益生菌复合发酵酸奶的工艺优化及其抗氧化性研究

秦楠，金婕妤，张芹仙，杜娇

（山西中医药大学制药与食品工程学院，太原030619）

0引 言

酸奶作为发酵型乳制品，不仅可以促进肠道消化、降低胆固醇，还可改善乳制品的风味和质地[1-2]。益生菌酸奶在改善人体肠道菌群分布和乳糖的代谢方面发挥着重要作用[3]。

北芪菇是平菇添加黄芪培育而成的一种新型食用菌，其营养价值更高，尤其硒含量较普通平菇提高15%[4]。具有抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、改善和预防心脑血管疾病、调节免疫，有助于胃肠运动、促进消化等药理作用[5-6]。红枣不仅含有丰富的营养成分，还富含多种生理活性物质，如红枣多糖、有机酸及黄酮类等物质，具有抗疲劳、安神益气、抗氧化多种保健功能[7]。

本研究以益生菌与传统乳酸菌合理配比复合发酵制备北芪菇红枣酸奶，并研究了其体外抗氧化活性，为工业化生产提供理论依据和实践指导。

1 实验

1.1 材料与仪器

益生菌为双歧杆菌(Bifidobacterium)；发酵菌种为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusbulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)。

培养基：MRS培养基，MC培养基，结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）培养基。

原料：北芪菇，北芪菇，市售红枣，纯牛奶，蔗糖（市售）。

仪器：榨汁机（BL25B36），HH-4数显恒温水浴锅，消解炉（SPT20），自动定氮仪（SPD60），电热鼓风干燥箱（GZX-9140MBE），电热恒温培养箱（HPX-9082MBE），高压灭菌锅（DY04-13-44-00），PH计（PHS-3C）。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

（1）红枣汁的制备工艺。

选料→清洗→浸泡红枣（60℃，3 h）→去核→煮制（料液比1∶3、70℃，20 min）→打浆→杀菌（121℃，20 min）→过滤→冷却→备用

（2）北芪菇红枣酸奶生产工艺流程。

纯牛奶→红枣汁、北芪菇粉→混合→过滤→标准化（加蔗糖）→均质（20 MPa，5 min）→杀菌→冷却→接种→罐装→发酵→后熟(4℃)→成品

1.2.2 单因素实验

改变单一因素，固定其他条件，分别考察北芪菇添加量、北芪菇与红枣汁比、蔗糖添加量、菌种复配比（益生菌：发酵菌种(德氏乳杆菌保加利亚∶嗜热链球菌=1∶1）、接种量、发酵时间与发酵温度，感官评分为评价指标，利用单因素实验确定各因素的最适范围。不同因子梯度条件如表1所示。

表1 单因素水平设计

1.2.3 响应面实验

基于单因素实验结果，选用中心组合实验Box-Behnken设计方案，选取北芪菇与红枣汁比、蔗糖添加量、接种量3个变量，以A，B，C来表示，并以+1，0，-1分别代表其变量的水平；按方程x=(X-X0)/△X对自变量进行编码，其中：x为变量的编码值；X为变量的真实值；X0为实验中心点变量的真实值；△X为变量的步长变化。感官评分Y表示响应值，如表2所示。

表2 响应面实验因素水平编码 %

1.2.4 检验方法

（1）感官评价。感官评价小组共10人，年龄在18-25岁之间，均接受过《食品感官分析》课程培训。根据表3感官评分标准对益生菌复合发酵北芪菇红枣酸奶进行感官评价。

（2）抗氧化活性的测定。将益生菌酸奶进行不同质量浓度梯度稀释，采用DPPH法和ABTS+法，分别测定其抗氧化活性[8-10]。

（3）活菌数的测定。益生菌酸奶采用生理盐水进行梯度稀释，用各种选择培养基平板倾注法，测定乳酸菌和双歧杆菌的活菌总数[11]。参考GB 4789.35-2010乳酸菌菌落数的测定方法[12]。

（4）滴定酸度的测定。参考GB5413-34-2010所述方法对发酵乳滴定酸度进行测定[13]。

（5）蛋白质质量分数测定采用凯式定氮法[14]。

表3 益生菌复合发酵北芪菇红枣酸奶感官评分标准

1.3 数据分析

本研究所有的试验数据均使用Origin和Design-Expert(version8.0.6)统计软件进行数据处理，运用最小差异显著法（LSD）进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 北芪菇添加量对酸奶感官评分的影响

如图1所示，随北芪菇添加量逐渐增大感官评分呈先升后降的趋势，酸奶组织状态无差异，当添加量为0.20 g时，酸奶北芪菇味适中且口感细腻，当添加量为0.25 g时，北芪菇的味道过重，且口感较粗糙。故选择北芪菇添加量为0.20 g。

图1 北芪菇添加量对酸奶感官评分的影响

2.1.2 北芪菇与红枣汁比对酸奶感官评分的影响

如图2所示，感官评分随着北芪菇与红枣汁比的升高先升后降，对酸奶口感影响较大。在比例为1∶25～1∶75之间，红枣和北芪菇复合味道较淡，黏稠性较好；当比例为1∶100时，复合味道适中，酸奶风味浓郁，黏稠性好，口感细腻，无乳清析出；1∶125时，红枣的味道过重，完全掩盖了北芪菇的味道，故选择北芪菇与红枣的配比为1∶100(质量体积比)。

2.1.3 蔗糖添加量对酸奶感官评分的影响

图2 北芪菇与红枣的配比对酸奶感官评分的影响

如图3所示，感官评分随着蔗糖添加量的增加呈现先升高再下降的趋势，影响显著。当添加量为3%时，酸奶口味略偏酸，但有淡淡的红枣味，口感较细腻；4%时，酸甜适口，有浓郁的酸奶味，并呈现出独特的北芪菇红枣复合风味，口感细腻，黏稠性好；当蔗糖添加量为5%～7%时，口感略甜，随糖量增加，逐渐掩盖了红枣的风味[15]。故选择蔗糖添加量为4%。

图3 蔗糖添加量对酸奶感官评分的影响

2.1.4 菌种复配比对产品品质的影响

如图4所示，感官评分随着益生菌与传统发酵菌种的比例变化呈现先升后降的趋势，比例为1∶3时，酸奶口感细腻，酸甜适口，黏稠性好；比例继续增大，酸味提高，对产品风味有较大影响，故先择菌种复配比1∶3。

图4 菌种复配比对酸奶感官评分的影响

2.1.5 接种量对酸奶感官评分的影响

如图5所示，随着复合菌种（益生菌：发酵菌种=1:3）接种量的增大，感官评分呈先上升后下降的趋势，影响显著。当接种量为0.02%～0.06%时，酸奶较为稀薄，口感略甜，可能是接种量少，发酵产酸不够所致；当接种量为0.10%时，有浓厚的酸奶风味，口感细腻柔和，黏稠性好，无乳清析出；当接种量为0.14%～0.18%时，有乳清析出，口感偏酸，黏稠度高。故选择接种量为0.10%。

2.1.6 发酵时间对酸奶感官评分的影响

图5 接种量对酸奶感官评分的影响

如图6所示，感官评分随着发酵时间的延长先上升再下降，当发酵时间为5 h时，酸奶酸甜适口，黏稠性好，口感细腻，柔和，感官评分达90分；故选择发酵时间为5 h。

图6 发酵时间对酸奶感官评分的影响

2.1.7 发酵温度对酸奶感官评分的影响

如图7所示，随着发酵温度的升高感官评分呈先长后降的趋势，当发酵温度为42℃时，酸奶酸甜可口，口感细腻，黏稠性好；温度过低会造成乳酸菌发酵不够，酸奶过甜，稀薄；温度过高则导致酸奶有少量的乳清析出，风味有些偏酸[16-17]。故选择发酵温度为42℃。

图7 发酵温度对酸奶感官评分的影响

2.2 响应面实验结果

（1）响应面实验设计与结果如表4所示。

（2）模型的建立及其显著性检验。利用Design-Expert(version8.0.6)软件对表3中实验数据通过多元回归拟合，得到益生菌复合发酵北芪菇红枣酸奶的感官评分（Y）对自变量北芪菇与红枣的配比（A）、蔗糖添加量（B）、接种量（C）的回归方程为

Y=89.40-3.37A+3.75B-0.88C-1.00AB-4.25AC-2.00BC-11.58A2-6.83B2-4.57C2。

由表4可知，实验模型的P＜0.0001，说明此模型极显著，模型失拟项表示模型预测值与实际值不拟合的概率，此模型失拟项P=0.5413＞0.05，表明模型不显著，拟合的概率高，运用到试验中误差小。该模型的相关系数R2=0.9888，且模型的调整确定系数R2Adj=0.9964，说明此模型能用于99.64%的实验结果解释，仅只有0.36%的试验结果不能用此模型解释，进一步说明了回归方程的拟合程度较好。

表4 Box-Behnken实验设计及结果

表5 回归模型方差分析

由表5中的F值的大小可以判断各因素对益生菌复合菌发酵北芪菇红枣酸奶质量影响的强弱，F值越大，说明该因素对于感官评价的影响程度越大。故根据上表可得出各因素对于北芪菇红枣酸奶感官评价的影响程度大小依次为蔗糖添加量（B）＞北芪菇与红枣汁比（A）＞接种量（C）。

根据上述回归方程绘制出响应面图，以确认北芪菇与红枣汁比、蔗糖添加量、接种量3个因素对益生菌酸奶质量的影响，如图8所示。

由图8可以看出，响应值随着北芪菇与红枣的配比、蔗糖添加量与接种量的增加均呈现先增大后减小的变化趋势，3个影响因素均存在一定的交互作用。从方差分析中可知，交互作用均极显著。各图中两个因素曲面坡度相似，说明在固定实验水平范围之内，两个因素对感官评分的变化影响相近。

2.3 验证实验

通过Design-Expert 8.0.6软件分析得，最佳的制备工艺条件为北芪菇与红枣汁比为1∶86（g/mL），蔗糖添加量为4.30%，接种量为0.10%，在此条件下的感官评价得分为90.2407分。考虑实际操作的方便性，将最适参数修正为：北芪菇与红枣的配比为1∶100（质量体积比），蔗糖添加量为4%，接种量为0.10%，为了验证模型预测的准确性，重复试验3次，所得平均值与理论预测值非常接近，且相对误差小于2%，说明重复性良好。

2.4 抗氧化活性的测定

以维生素C作为对照，分别测定益生菌酸奶对DPPH、ABTS+自由基的清除效果，二者都表现出有很好的清除能力，而且与酸奶浓度成正比。这可能是由于添加北芪菇、红枣后，酸奶中增加了多糖、酚类、蛋白质等生物活性物质，进而提高了样品的抗氧化能力[18]。其中，对比两种自由基清除能力发现，清除DPPH自由基的能力较ABTS+自由基高。

图8 各因素交叉作用对益生菌酸奶的感官评分影响的响应面和等高线

2.5 储藏期内益生菌酸奶活菌数的变化

由图9可知，益生菌酸奶中活菌总数随着储藏时间的延长，在10～16 d期间菌数增长量大、增速快；随着储藏时间延长菌数逐渐下降，这可能是由于活菌产生的代谢产物增多，造成的酸性环境对其菌体本身产生抑制，同时导致菌体进入老化、衰亡期[19]。

图9 储藏间内发酵乳活菌数的变化

2.6 产品质量评价

（1）感官指标。色泽：色泽均匀一致，乳黄色。组织状态：细腻、均匀，允许有少量乳清析出。滋味：酸甜适口，口感丝滑，酸奶香气浓郁，有爽口的红枣味和淡淡的北芪菇味，无异味。

（2）理化指标。蛋白质为4.3%，酸度为74.2°T，p H值为4.5。均符合发酵乳GB19302-2010相关规定。

（3）微生物指标。乳酸菌总数为4.4×107mL-1；菌落总数＜100 mL-1；大肠菌群数、致病菌未检出。

3 结 论

试验对北芪菇红枣酸奶的口感、酸度、活菌数进行了测评，通过单因素与响应面设计与分析，探索了益生菌双歧杆菌与传统乳酸菌(德氏乳杆菌保加利亚亚和嗜热链球菌)复合发酵北芪菇红枣酸奶的工艺条件。最佳条件为：北芪菇添加量为0.2 g，北芪菇与红枣汁的配比为1∶100(质量体积比)，益生菌与发酵菌比例1∶3，接种量0.1%，蔗糖添加量为4%，发酵温度为42℃，发酵时间为5 h。按此配方研制的益生菌酸奶蛋白质含量为4.38 g/100 g，酸度为74.2°T，乳酸菌总数为4.4×107mL-1，p H值为 4.5，口感细腻，色泽均匀。在储藏期内活菌数表现出良好的稳定性，优于传统乳酸菌菌种发酵的同类产品。经添加北芪菇、红枣汁制备的新型复合酸奶对DPPH和ABTS+均有较强的抗氧化性，且对DPPH自由基的清除能力更强，是一款风味独特、营养保健型的复合酸奶。