兔轮状病毒病的诊治

于新友，李天芝

（山东绿都生物科技有限公司，滨州 256600）

兔轮状病毒病（Lapine rotavirus disease）是由呼肠孤病毒科轮状病毒属兔轮状病毒（Lapine rotavirus）引起的一种兔的腹泻性病毒病［1］。各日龄兔均可感染，1～2月龄幼兔受到的危害较严重，成年兔可长期隐性带毒［2］。该病一年四季均可发生，冬、春季节多发［3］。该病发病急，发病率高，传播迅速［4］。病兔和带毒兔是传染源。病毒随病兔粪便排出体外，污染饲料、饮水及环境通过消化道感染其他健康兔。病毒对外界环境抵抗力强［5］，兔场一旦感染后很难清除。2017年12月山东滨州某肉兔养殖场，饲养的200多只1月龄幼兔发生水样腹泻，陆续死亡20多只，抗生素治疗无效，送本公司兽医诊断中心就诊，据临床症状、剖检病理变化以及实验室检测，诊断为兔轮状病毒病，并提出了一系列的防治措施，使疫情得到控制，现将病例诊治情况报告如下。

1 临床症状

病兔精神沉郁、食欲减退;被毛粗乱;发生水样腹泻粪便,呈浅绿色或灰白色，且含血液或黏液，有恶臭味，肛门周围和后肢被粪便污染;病兔迅速消瘦、脱水，腹泻2～3 d后死亡。

2 病理变化

对6只死亡兔和2只濒死兔剖检，可见胃内充满未消化乳汁，小肠出血、膨胀，内充满灰黄或灰黑色液状，结肠淤血，盲肠扩张，肠黏膜脱落，肠壁变薄，半透明状，肠系膜淋巴结肿大，其他器官未见明显变化。

3 诊断

3.1 细菌检查

无菌采取病死兔肝脏、脾脏涂片，革兰氏染色、镜检，未发现细菌，将病料划线接种于血琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基上，37℃下培养24 h，均未见细菌生长。

3.2 球虫检查

取10 g新鲜兔粪便放于烧杯中，加入100 mL饱和食盐水中，搅拌混匀，单层纱布过滤，将滤液倒入100 mL量筒中，静置30 min，用接种环蘸取表面液体，涂于载玻片上，加盖玻片，镜检，未发现球虫卵囊。

3.3 病毒检查

取病死兔新鲜粪便，称重，按1∶10加入灭菌生理盐水，反复冻融3次后，12 000 r/min离心10 min，取上清液，用孔径0.22 μm的滤器过滤后，-70℃保存备用。

3.4 RT-PCR检测

参照兔轮状病毒VP7基因序列（U62153），采用Primer Premier 5.0引物设计软件，设计1对引物，上游引物：5′-AATTTCCGCCTGGTTAGC-3′，下游引物：5′-ATCAAATCTGCGAGTTCC-3′，扩增片段大小为 507bp。按AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒使用说明书提取3.3处理的病料样品的RNA，进行一步法RT-PCR扩增。扩增反应程序：50℃30 min，95℃3 min，然后进入95℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共 35 个循环，最后 72 ℃延伸8 min。取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示，在513 bp处有光亮条带，与理论值大小相符（见图1），PCR产物纯化回收后与pMD18-T连接，转化感受态DH5α，挑取阳性菌送样测序，结果见图2，经比对后显示与参照的兔轮状病毒VP7基因同源性为100%。因此，可基本确定兔死于兔轮状病毒感染。

注：M.DL2000 MarKer，1.病料检测扩增结果，2.阴性对照。

图2 扩增产物测序结果

3.5 动物回归实验

6只1月龄幼兔，分成2组，实验组4只，对照组2只。实验组兔灌服3.3处理的病料，每只2 mL，对照组兔灌服生理盐水，每只2 mL，隔离饲养观察。结果4只实验兔均陆续出现水样腹泻，3 d内全部死亡，剖检可见小肠出血，肠壁变薄，肠黏膜脱落，内充满稀粪。取粪便样品一步法进行RT-PCR扩增,检测兔轮状病毒核酸，结果为阳性，对照组家兔均健活。

4 治疗措施

兔舍发病后，病死兔焚烧或深埋处理，对被污染的环境及用具等彻底消毒。兔舍保持清洁、温暖、干燥，挑出病兔，隔离饲养，并口服补液盐、电解质，纠正脱水，防止酸中毒;同时采用收敛止泻剂，缓解症状。饮水中添加抗生素，控制细菌继发感染。

5 讨论与小结

幼兔腹泻病是导致幼兔死亡的一类重要疾病，给养兔业造成了一定的经济损失。引起幼兔腹泻的病原主要有大肠杆菌、魏氏梭菌、沙门氏菌、泰泽氏菌、球虫、轮状病毒等［6］。对于细菌和球虫可用抗生素进行预防和治疗，而对兔轮状病毒引起的腹泻目前尚无有效的治疗方法，也无疫苗预防。因此，平时要加强饲养管理，饲喂优质全价饲料，饮用干净水。尽量减少引种，引种时要隔离观察半个月，确认健康后，再并入大群饲养。兔舍要保持适宜的温度、湿度，加强通风,定期清理粪便，每周至少消毒1次。

兔轮状病毒可用恒河猴胚肾细胞（MA-104）和非洲绿猴肾细胞（CV1）分离培养［7］，一般初次分离培养较困难、周期长。本研究受条件所限并没有对病毒分离培养，结合病兔临床症状、病原PCR检测及基因测序结果初步显示幼兔死于轮状病毒感染。采用病料处理液直接攻毒兔，成功复制出幼兔腹泻的病例，充分表明该病毒对幼兔具有一定的致病力，下一步打算做病毒的分离，并进一步研究病毒的特性。