BMP4和SMAD4基因在公绵羊繁殖相关组织的表达

2019-03-29采复拉大木拉田志龙段新华储明星

中国草食动物科学 2019年2期

采复拉·大木拉，田志龙，段新华，储明星

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193；2.新疆畜牧科学院畜牧业质量标准研究所，乌鲁木齐 830000；3.河南科技大学动物科技学院，洛阳 471003）

转化生长因子 β（Transforming growth factor-β，TGF-β）超家族可以调节动物细胞的增殖、分化、凋亡，影响动物的胚胎发育、器官形成以及细胞外基质合成和稳态［1］。近些年研究发现，TGF-β超家族对胚胎原始生殖细胞形成［2］、睾丸发育、生殖细胞增殖分化［3］、动物出生后睾丸正常功能维持［4］、精子生成等过程发挥着重要的生理调控作用。BMP4基因作为TGF-β超家族成员，参与多种生命活动，促进小鼠精原干细胞的分化［3］。Smad4蛋白是TGF-β超家族的常见转导因子，参与TGF-β超家族所有成员的信号传导。Smad4在小鼠睾丸中表达，并且被认为在睾丸发育和精子发生过程中起重要作用［5］。目前，对于BMP4和SMAD4的研究比较多，但BMP4和SMAD4基因对公绵羊繁殖性状的作用模式还未确定。因此，本研究以低繁殖力苏尼特羊公羊和高繁殖力小尾寒羊公绵羊为试验材料，采用荧光定量PCR技术检测BMP4和SMAD4基因在不同繁殖力公羊下丘脑-垂体-睾丸轴等组织中的表达，以探索BMP4和SMAD4基因在公绵羊繁殖中的作用，为深入理解公绵羊繁殖机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

小尾寒羊来自山东省郓城县大鹏农牧科技有限公司，苏尼特羊来自内蒙古乌拉特中旗。从中随机挑选性成熟且健康状况良好的公羊各3只。屠宰后分别采集大脑、小脑、下丘脑、垂体、输精管、肾上腺、睾丸和附睾组织，液氮中保存直至提取RNA。RNA提取试剂盒购于天根生化科技有限公司（北京），反转录试剂盒和荧光定量染料均购于大连宝生物；2×Taq PCR Master Mix购于拓英坊科技有限公司（北京）。

1.2 RNA提取和检测

使用试剂盒提取组织总RNA（详见试剂盒说明书），使用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，利用仪器测定其纯度和浓度。

1.3 引物设计

利用Primer Premier 6.0软件设计荧光定量引物。以RPL19基因做内参基因。引物具体信息见表1。

表1 绵羊BMP4、SMAD4和RPL19基因的引物序列和产物大小

1.4 荧光定量PCR

试验用cDNA合成及RT-PCR和荧光定量PCR试验过程参考文献［6］。按反转录试剂盒提供步骤进行cNDA的合成，使用2×Taq PCR Master Mix对目的基因进行PCR，最后使用SYBR®PremixExTaqTMⅡ进行荧光定量检测。荧光定量PCR数据处理参考文献［6］，即以 RPL19 为内参基因，使用 2-△△CT法［7］计算目的基因相对表达量，采用SPSS19.0统计软件对数据进行单因素方差分析，使用邓肯氏（Duncan's）进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 RNA提取与cDNA合成

利用1.5%琼脂糖凝胶电泳对RNA完整性进行检测，结果表明，RNA完整性良好。使用内参基因对cDNA进行检测，结果显示（图1），目的片段与预期的一致，可用于后续的荧光定量试验。

图1 cDNA电泳检测

2.2 BMP4和SMAD4基因在不同品种公羊繁殖相关组织中的表达

运用qPCR对小尾寒羊公羊和苏尼特羊公羊8种繁殖相关组织中BMP4和SMAD4基因的表达量进行了研究，结果见图2。两个品种比较发现，BMP4和SMAD4在公绵羊各种组织中均有表达，其中BMP4基因在睾丸中高表达，其次是输精管、肾上腺，在其他组织中均呈痕量表达。SMAD4基因在睾丸、下丘脑、小脑、大脑中高表达，在其他组织中均中等表达。BMP4基因在低繁殖力苏尼特公羊睾丸中表达量显著高于高繁殖力小尾寒羊公羊（P＜0.05）。SMAD4基因在低繁殖力苏尼特公羊8种组织表达量均显著高于高繁殖力小尾寒羊公羊（P＜0.05）。

图2 BMP4和SMAD4基因在不同品种公羊繁殖相关组织中的表达

3 讨论

骨形态发生蛋白（BMPs）是转化生长因子β超家族中最大的一个亚家族［8］。BMP4是BMP亚家族中的重要成员之一，在哺乳动物体内发挥广泛的调控作用。在生殖系统调节中，睾丸和卵巢是BMP4作用的重要靶器官［9］。研究发现，BMP4不但可促进初级卵泡转化为次级卵泡［10］，还可促进牛卵巢原始卵泡以及次级卵泡直径的增加并调控牛卵母细胞成熟［11］。徐业芬［12］发现，BMP4抗体处理湖羊卵母细胞可以导致其凋亡并消失。推测BMP4基因是原始卵泡和卵母细胞生存必需因子，可促进卵泡颗粒细胞进一步分化，排卵卵泡进一步成熟，最终表现为排卵数增加。BMP4基因不仅在绵羊卵巢中发挥作用，还在山羊中也发挥着重要功能［13］。秦立红等［14］报道，BMP4基因在草原红牛不同发育时期睾丸组织中均有表达，这说明BMP4基因在草原红牛睾丸组织中可能发挥重要作用。本研究发现，BMP4基因在低繁殖力苏尼特公羊睾丸中表达量显著高于高繁殖力小尾寒羊公羊（P＜0.05），这和前人研究结果基本一致。

TGF-β超家族信号通路在卵泡发育、卵母细胞生长以及颗粒细胞增殖、哺乳动物睾丸发育及精子形成中起重要作用。Smad4作为该信号通路的中心分子在TGF-β 信号转导过程中起关键作用［15］。王玉恒等［16］研究发现，Smad4在牦牛的多个组织中均有表达，尤其是在生殖系统的卵巢、输卵管、子宫组织中广泛表达。郝晓霞［17］研究发现，Smad4在小鼠睾丸支持细胞、莱氏细胞、管周肌样细胞和除长形精子之外的所有生殖细胞中表达。在支持细胞中敲除Smad4能够影响胎儿睾丸索扩张，单独敲除莱氏细胞中的Smad4对胎儿及成年鼠睾丸发育无影响。在支持细胞和莱氏细胞中同时敲除Smad4，能够导致小鼠睾丸不育和肿瘤形成。高真真［18］使用免疫印迹法和免疫组织化学法检测发现，Smad4在成年鹌鹑和鸡的睾丸生殖细胞和支持细胞中高表达。本研究表明，SMAD4基因在睾丸、下丘脑、小脑、大脑中高表达，且低繁殖力苏尼特羊公羊显著高于高繁殖力小尾寒羊公羊（P＜0.05），再次验证了SMAD4基因对于睾丸功能以及相关繁殖组织的重要作用。