黄连素对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的影响及相关炎症因子的表达变化

郑海雅　兰俊　吕雷立　黄振强

[摘要] 目的 探讨黄连素在大鼠肾脏缺血再灌注损伤中的作用。 方法 40只雄性SD大鼠随机分为对照组（S组）、模型组（IR组）、黄连素组（H组）和黄连素+Exendin-（9-39）组（HE组）。S组给予生理盐水及行假手术处理，IR组给予生理盐水，H组给予黄连素，HE组给予黄连素+ Exendin-（9-39），三组制作大鼠肾脏缺血再灌注模型。观察肾组织病理学改变，检测造模前及造模12 h和24 h后血清中肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）水平及血清白细胞介素（IL）-10、血管内皮生长因子（VEGF）以及肾组织中肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-1β、IL-6的含量。本次实验研究时间为2016年9～11月。 结果 模型制作成功，血清 BUN、Cr 水平在H组中低于IR组（P<0.05），而HE组低于H组（P<0.05）;IR组、H组、HE组中IL-10、IL-6、TNF-α、VEGF水平均高于S组（P<0.05），HE组IL-6、TNF-α水平较H组明显降低（P<0.05）。四组IL-1β水平无明显变化。 结论 黄连素能有效改善肾脏缺血再灌注大鼠的肾功能，其机制可能与抑制肾脏组织炎症反应有关。

[关键词] 黄连素;肾脏缺血再灌注;炎症因子;保护作用

[中图分类号] R692          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）02-0032-05

黄连素（berberine，BR）又称小檗碱，是从黄连、黄柏等中藥中发现的生物碱，具有抗肿瘤[1，2]、抗炎[3，4]、抗菌[3-5]、抗氧化[6]、保护心血管[7，8]等诸多的药理作用。近年来黄连素对急性损伤的保护作用已经引起医学研究者的重视[9]。1985年至今，国内外开展大量有关黄连素对急性损伤保护作用的研究，证实黄连素通过减轻脂质过氧化、调节相关炎症因子水平等方式可对急性损伤起到保护作用。黄连素在大鼠心肌缺血再灌注中进行广泛研究[10，11]，但黄连素是否对缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）引起的肾脏损伤也具有保护效应，至今鲜有报道。本文采用大鼠缺血再灌注模型，模拟肾脏缺血再灌注损伤，观察黄连素对损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料来源

选择40只成年雄性SD大鼠，体重为220～240 g，2016年9月购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号为SCXK（京）2016-0011。动物饲养和处理均按照我院实验动物管理规定执行。本研究经过我院伦理委员会批准通过。黄连素（纯度98%）购于上海阿拉丁试剂有限公司，Exendin-（9-39）购于上海浩然生物技术有限公司，尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）试剂盒购于南京建成生物工程研究所，IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α、VEGF等酶联免疫检测试剂盒购于上海碧云天生物技术研究所。本次实验研究时间为2016年9～11月。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组、药物干预方法及模型制备  40只SD大鼠用普通饲料适应性饲养1周后，随机分为对照组（S组）、模型组（IR组）、黄连素组（H组）和黄连素+Exendin-（9-39）组（HE组），每组各10只。S组、IR组给予生理盐水2 mL/d，连续7 d腹腔注射，S组行假手术处理，H组给予黄连素0.4 mg/（kg·d）（0.4 mg黄连素粉溶解于2 mL生理盐水）连续7 d腹腔注射，HE组给予黄连素0.4 mg/（kg·d）（0.4 mg黄连素粉溶解于2 mL生理盐水）腹腔注射7 d+Exendin-（9-39）45 μg/kg/3 d腹腔注射（在第1、4天注射），IR组、H组、HE组在连续注射7 d后制作大鼠肾脏缺血再灌注模型。首先对大鼠腹腔注射2%的戊巴比妥钠（40 mg/kg）进行麻醉，大鼠以仰卧位固定至手术台，四肢固定，用医用酒精进行腹部消毒，从腹部正中线切口暴露左肾和右肾，分离出肾包膜及肾动静脉，使肾蒂游离，切除右侧肾，IR组、H组、HE组使用无损伤动脉夹夹闭左肾肾蒂，此时，肾脏颜色变为暗红色说明肾脏血流被阻断，45 min后松开动脉夹使血流恢复供应，肾脏颜色变为鲜红色，即认为IR模型制备成功。S组在切除右肾后，仅使左侧肾蒂游离，而不阻断血流，暴露45 min后，逐层关闭腹腔。

1.2.2 血清BUN、SCr、IL-10、VEGF水平测定  制备模型前，每组大鼠经颈静脉窦取血2 mL，以测大鼠血清造模前BUN、SCr、IL-10、VEGF水平，在制备模型处理或假手术处理12 h和24 h后，麻醉大鼠，经心脏取血4 mL，每次取血后离心留取血清，依照BUN、SCr试剂盒（南京建成生物工程研究所）的操作说明，经日本Olympus Au2700 全自动生化分析仪检测各时间点血清BUN、SCr水平。按照ELISA实验操作及VEGF、IL-10试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）说明测定12 h和24 h时间点血清中VEGF、IL-10的水平。

1.2.3 肾组织学观察及肾组织炎症因子测定  各组大鼠取血后，切取左侧肾脏，固定采用4%多聚甲醛，制备石蜡切片，用苏木素-伊红（HE）染色，置于日本Olympus显微镜下（×200）观察病理变化。部分剩余肾脏组织称量，切碎，以1：10的比例加入生理盐水，进行匀浆，在4500 r/min、4℃条件下离心15 min，取上清液，按照ELISA实验操作及IL-6、IL-1β、TNF-α试剂盒（上海碧云天生物技术研究所）说明测定肾组织中IL-6、IL-1β、TNF-α的水平。

1.3 统计学分析

应用SPSS 21.0统计学软件进行分析。计量资料采用（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肾功能检测结果

S组大鼠血清BUN、SCr水平在造模前、造模后12 h和24 h时间点无明显差异，在造模成功12 h和24 h后，IR组、H组及HE组血清BUN、SCr水平明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05），并且IR组大鼠血清BUN、SCr水平升高最为明显。在造模成功12 h及24 h后IR组、H组及HE组血清BUN、SCr水平高于造模前及S组血清水平（P<0.05），H组及HE组BUN、SCr水平明显比IR组低（P<0.05），造模24 h后HE组血清BUN、SCr浓度较H组低（P<0.05），见表1。

2.2 各组大鼠肾脏组织病理学变化

HE染色后，顯微镜下（×200）可看到S组肾小球、肾小管结构完整，清晰可见，管腔无堵塞，无明显组织形态异常。IR组肾小管可看到上皮细胞出现明显肿胀、坏死，刷状缘大量脱落，部分肾小管发生管型及管腔阻塞，有大量中性粒细胞浸润肾间质。与IR组比较，用药组肾小管肿胀稍轻，病变程度有所减缓，肾小管刷状缘可见少量脱落细胞，肾小管基底膜完整性较好，肾小管中管型少见。与H组比较，HE组改善程度较好，肾小管肿胀较轻，肾间质未见明显中性粒细胞，肾小管刷状缘未见明显脱落（封三图1）。

2.3 ELISA检测IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10结果

IL-6、IL-1β、TNF-α对肾脏缺血再灌注损伤有损害作用，IL-10对肾脏缺血再灌注损伤发挥保护作用，四种细胞因子在肾脏缺血再灌注损伤后均可能出现升高情况。结果显示，在造模成功12 h和24 h后，IR组、H组及HE组血清IL-10含量水平明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05），并且用药组大鼠血清IL-10水平升高最为明显（表2）。IR组、H组、HE组肾组织匀浆的IL-6、TNF-α水平均高于S组（P<0.05），其中IR组肾组织IL-6、TNF-α浓度最高（P<0.05）。与H组相比，HE组IL-6、TNF-α水平均明显降低（P<0.05，表2）。IR组、H组、HE组血清中的IL-10水平均高于S组（P<0.05）。与S组比较，IR组、H组、HE组小鼠肾组织匀浆IL-1β水平无明显变化（P>0.05）（表2）。

2.4 ELISA检测血清VEGF结果

IR组、H组、HE组术后12 h和24 h血清VEGF的表达均高于相同时间点的S组（P<0.05）;在相同时段内，H组、HE组血清VEGF的表达低于IR组（P<0.05），见表3。

3 讨论

有研究表明[12]，肾小球滤过率作用减弱与肾小球、肾小管的变化伴随间质性炎症有关，肾脏缺血再灌注可以通过降低微小血管的血流量、诱发内皮细胞功能紊乱、引起白细胞介导的炎症反应，从而导致急性肾损伤。在临床研究中，肾脏缺血再灌注损伤好发于冠脉搭桥、心脏体外大循环、肾移植等手术，可导致大量肾单位严重的破坏，如大量肾小管上皮细胞出现肿胀、受损现象，肾小管刷状缘大量脱落，空泡大量变性、坏死，肾间质大量炎症细胞浸润等病理改变，致使肾小球滤过率急剧下降，肾小管重吸收功能减弱，引起血清BUN、SCr增高等。本研究结果显示，IR组血清BUN、SCr浓度较S组明显升高，显微镜下观察IR组肾脏组织形态结构明显异常，小管管腔显著肿胀、坏死，损伤严重部位肾小管阻塞，刷状缘大量脱落，肾间质出现充血性水肿，肾组织受到大量中性粒细胞浸润等病理改变。这些病理特征提示IR模型建立成功。黄连素是一类常见的异喹啉类生物碱，有研究表明[13]该药物治疗消化系统疾病与腹泻有着较好的疗效，但是通过口服给药吸收不理想，在体内首过效应较强，血药浓度持续时间短，因此本研究采用腹腔注射给药方式。Exendin-（9-39）是一种天然的胰高血糖素样肽-1天然拮抗剂，有研究表明[14-16]Exendin-（9-39）可以促进胃肠蠕动，增强胃肠的吸收功能。本研究结果证实，黄连素+ Exendin-（9-39）组（HE组）、黄连素组（H组）肾脏组织病理形态结构与模型组（IR组）相比较为缓解，提示该药物可减弱肾脏缺血再灌注损伤，缓解受损程度; 与黄连素组相比，黄连素+Exendin-（9-39）组对肾脏缺血再灌注损伤病理学变化明显改善，提示黄连素应用时，可适当联合应用Exendin-（9-39），可增强机体对黄连素的吸收，增加药效，但本实验尚缺乏对黄连素联合Exendin-（9-39）用药机制，联合用药有待进一步研究。与IR组相比，黄连素腹腔注射给药干预大鼠能明显降低血清BUN、SCr含量，血清BUN、SCr含量水平是肾脏缺血再灌注损伤后发生变化的重要指标，H组、HE组BUN、SCr含量较低也表明黄连素能减轻肾脏缺血再灌注对大鼠造成的损伤，因此黄连素对IR大鼠有明显的保护作用，但黄连素对IR大鼠有保护机制目前鲜有文献报道[17-19]，有待进一步研究。

研究表明[20-22]，当发生缺血再灌注损伤时，涉及钙超载、氧自由基产生、细胞凋亡等多种细胞反应，在此过程中会有众多免疫因子和炎症介质的参与，而炎症反应参与了组织损伤的整个过程。在肾脏缺血再灌注损伤时，机体发生炎症反应，大量释放促炎细胞因子，血管内皮细胞和白细胞表面黏附分子表达升高、血管内皮细胞与白细胞黏附、白细胞被激活及对组织造成损伤作用[23]。在炎症反应的过程中，巨噬细胞则发挥重要作用，它既发挥效应细胞功能，同时也发挥抗原递呈细胞的作用。巨噬细胞被活化后，吞噬病原体并释放多种重要的炎症因子如IL-1、IL-6、IL-10、IL-1β和TNF-α。正常情况下，巨噬细胞驻守肾脏中的数量较少，但在肾脏缺血后即出现快速聚集现象。近年来大量研究证实[24-28]由炎症细胞以及炎症因子介导的相关炎症反应在IR的发病中起重要作用，肾脏缺血再灌注时，大量巨噬细胞随着血流灌注融入肾组织，在肾组织中分泌细胞因子，致使白细胞被激活，并汇聚中性粒细胞、诱导细胞凋亡，使炎症反应瀑布样激活，进一步加重肾脏损伤。在炎症反应网络中，IL-6、IL-1β、TNF-α是重要的促炎细胞因子，TNF-α通过上调血管内皮黏附因子表达，增加血管内皮细胞与中性粒细胞黏连，导致炎症细胞渗出、迁徙，致使机体组织微循环受阻，造成损伤;IL-6和IL-1β可促进粒细胞介导的炎症反应以及中性粒细胞激活，进而加重肾脏损伤程度。而IL-10对肾脏缺血再灌注损伤主要发挥保护作用。因此，研究TNF-α、IL-6、IL-10和IL-1β等炎症因子表达水平对大鼠肾脏缺血再灌注损伤机制具有重要的作用[29]。本课题研究显示，与S组比较，IR组、H组、HE组血清炎症因子IL-10及肾组织IL-6、TNF-α水平均明显升高，表明在大鼠肾脏缺血再灌注导致的肾组织损伤中，机体炎症反应被激活，抑炎因子和促炎因子水平均升高。此外，本研究结果显示用黄连素对大鼠进行腹腔注射处理可明显降低肾脏缺血再灌注损伤中促炎细胞因子IL-6、TNF-α水平，提高抑炎细胞因子IL-10水平，表明黄连素预处理减轻肾脏缺血再灌注损伤可能与抑制炎症反应相关。与H组相比，HE组IL-6、TNF-α水平均明显降低，因此可认为黄连素对细胞因子IL-6、TNF-α水平的分泌作用可能有剂量依赖关系，但S组、IR组、H组、HE组小鼠肾组织匀浆IL-1β水平无明显变化，可以认为黄连素与细胞因子IL-1β水平的分泌作用可能不相关。但黄连素在肾脏再灌注损伤抑制炎症的具体机制不清，有待进一步研究。

大鼠缺血再灌注损伤后，有多种细胞因子参与机体病理生理反应，除炎症因子IL-6、TNF-α等参与外，血管内皮生长因子也是重要的一种[30，31]。VEGF是一种促内皮细胞分裂素，其主要作用为促进内皮细胞分裂，增殖血管内皮细胞，从而促进血管新生，新生血管数目和血管密度与VEGF密切相关。血管新生中重要环节的发生，如血管形成、细胞移行、内膜修复并维持其完整性等，均受VEGF影响。本次实验研究发现，大鼠肾脏缺血再灌注损伤后，血清中VEGF明显升高，因此，VEGF对肾脏缺血再灌注损伤的诊断和治疗有一定的参考价值;用黄连素对大鼠进行腹腔注射处理可明显降低肾脏缺血再灌注损伤中VEGF表达水平，表明黄连素预处理减轻肾脏缺血再灌注损伤还可能与降低VEGF的表達相关。由于VEGF表达的相关信号通路较为复杂，因此黄连素预处理在肾脏缺血再灌注损伤中降低VEGF表达的具体机制尚不明确，有待深入研究。

综上所述，黄连素后处理可减轻肾脏IR损伤，改善肾脏功能、减缓肾组织的损伤程度，抑制炎症应激反应可能是其作用机制之一，但由于肾脏IR损伤发生机制、该药物的作用机制的复杂性，黄连素保护作用与肾脏IR损伤的确切关系有待更进一步研究。

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（收稿日期：2018-05-31）