明党参根皮中五种香豆素对H2O2诱导的HUVEC的保护作用研究

王萌

摘要：目的：研究从明党参根皮超临界提取物中分得的5个香豆素化合物对体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）氧化应激损伤的保护作用，以为其在动脉粥样硬化疾病上的运用提供理论依据。方法：以过氧化氢（H2O2）为氧化剂建立HUVEC细胞氧化应激损伤（OSI）模型，细胞种板经过24h孵育贴壁后，将细胞分为正常对照组、H2O2氧化损伤组、实验药物组，其中实验药物组给予药物预培养24h后，加入500μmol·L-1 H2O2，继续培养4h后MTT法检测细胞存活率。结果：5种呋喃香豆素均能改善H2O2所致的HUVEC细胞形态学损伤，提高细胞存活率，其中欧前胡素效果最好，能使细胞存活率提高22%。结论：5种呋喃香豆素具有保护血管内皮细胞免受过氧化损伤的作用。

Abstract： Objective： To study the protective effects of five coumarins compounds from the supercritical fluid extract of Changium smyrnioides Wolff root bark on oxidative stress injury of cultured human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） in vitro， to provide a theoretical basis for its application in atherosclerotic disease. Methods： The oxidative stress injury （OSI） model of HUVEC cells was established by using hydrogen peroxide （H2O2） as oxidant. After 24 hours incubation， the cells were divided into normal control group， H2O2 oxidative injury group， experimental drug group. After 24 h of incubation， 500 μmol·L-1 H2O2 was added to the experimental group. The cell viability was measured by MTT assay after 4 h. Results： All the five furocoumarins could improve the morphological damage of HUVEC cells induced by H2O2， and the cell viability was improved. The effect of imperatorin was the best， and the cell survival rate was increased by 22%. Conclusion： The five furocoumarins have protective effects on endothelial cells from peroxidative injury.

关键词：明党参根皮；香豆素；内皮细胞；氧化应激损伤；保护作用

Key words： Changium smyrnioides Wolff；coumarin；endothelial cell；oxidative stress injury；protective effect

中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2016）36-0132-03

0 引言

明党参Changium smyrnioides Wolff为伞形科明党参属药用植物，根供药用，始载于明、清时期，为历版《中国药典》的名贵中药，主产于江苏、浙江、安徽三省，具有“补气生津，润肺化痰，平肝和胃，消肿解毒”的功效[1]。由于人类挖掘和生境的破坏，其分布区和个体数量正日益减少，近年来其种群呈现明显衰退倾向，1984年被列入国家三级濒危保护植物[2]。目前国内外对明党参根、茎叶、果实的研究已有文献报道[3-5]，但对其加工废弃的根皮的研究尚未见报道。前期本课题组从明党参根皮中分离得到五种呋喃香豆素类成分，分别是珊瑚菜内酯、花椒毒酚、欧前胡素、5-羟基-8-甲氧基补骨脂素、异欧前胡素。为了探讨这5种化合物的体外活性，本研究以H2O2作为氧化剂，建立HUVEC细胞的OSI模型，观察不同浓度的呋喃香豆素对此细胞的保护作用。

1 材料、仪器与试剂

1.1 实验材料

5种呋喃香豆素类成分，分别为珊瑚菜内酯、花椒毒酚、欧前胡素、5-羟基-8-甲氧基补骨脂素、异欧前胡素，由本实验室从明党参根皮中分离得到，它们的结构通过1H-NMR，13C-NMR和MS确定，并且通过液相色谱分析其纯度均大于98%。5种呋喃香豆素用超纯水配置成终浓度分别为0.01μmol·L-1、0.1μmol·L-1、1μmol·L-1、5μmol·L-1的一系列溶液（DMSO助溶）。

细胞株：人脐静脉内皮细胞株（HUVEC）为本校基础医学院保存细胞株。

1.2 主要仪器和试剂

超净工作台：SW-CJ-1F，苏州净化；

CO2细胞孵育箱：MCO-20AIC，SANYO，Japan；

倒置生物显微镜：CKX31SF，Olympus Corporation，Japan；

酶标仪：Model680，BIO-RAD，USA；

DMEM培养基：Gibco，USA；

超低温冰箱：Forma-86CULTFreezer，Thermoelectron corporation，USA；

新生牛血清：NBS，杭州四季青生物工程材料有限公司；

高速冷冻离心机：CP80MX，Hitachi Koki Co. Ltd；

双抗：青-链霉素，Amresco，USA；

平板式离心机：SorvallST16centrifuge，Thermo Fisher Scientific，USA；

胰蛋白酶：Gibco，USA；

荧光显微镜：1X70，Olympus Corporation，Japan；

磷酸盐缓冲液（PBS溶液）：自制；

四甲基偶氮唑（MTT）：Biosharp，USA；

二甲基亚砜（DMSO）：Amresco，USA；

H2O2：30%，AR级，国药集团化学试剂有限公司。

2 实验方法

2.1 细胞培养和传代

常规方法复苏冻存的HUVEC细胞，用含10%新生牛血清（FBS），（链霉素100mg·L-1）/青霉素（1×105IU·L- 1）的DMEM培养基在37℃，5%CO2饱和湿度培养箱内培养。将生长良好的HUVEC用胰蛋白酶消化2～3min后，轻轻吹打，制成细胞悬液，每周传代2～3次。待细胞状态稳定后移至96孔培养板上，分组实验。

2.2 药物浓度范围的选择

将细胞培养至对数生长期和80%融合度后，以0.25%胰酶溶液消化，用含10%新生牛血清的相应培养液制成单细胞悬液，进行细胞计数后，将细胞浓度调整为5×104个/ml。以每孔100μL的体积接种于96孔板，培养24h。实验组加入不同浓度的药物，每孔20μL，对照组加入等体积的超纯水，培养24h。每孔加入1g·L-1 MTT溶液20μL，37℃继续孵育4h，弃去上清液，每孔加入150μL DMSO，用涡旋振荡器振荡摇均匀后，用酶标仪在490nm波长处测定各孔吸光度值，并计算细胞存活率（%）。

2.3 H2O2浓度的筛选

HUVEC细胞按5×103个/孔接种于96孔板，培养24h贴壁后加入不同浓度的H2O2（100μmol·L-1、300μmol·L-1、500μmol·L-1、700μmol·L-1、900μmol·L-1）造模，并设置对照组，孵育4h后加入MTT，4h后吸弃上清液，加入150μL二甲基亚砜，振荡混匀后于酶标仪上测定490nm波长的吸光度。

2.4 药物对氧化应激损伤HUVEC细胞的影响

HUVEC细胞按5×103个/孔接种于96孔板，培养24h贴壁后将细胞随机分为3组：正常对照组、H2O2氧化损伤组、实验药物组。其中实验药物组给药保护24h后加入H2O2，作用4h后，去掉培养基，加入MTT，孵育4h后，吸弃上清液，加入150μL二甲基亚砜，振荡混匀后于酶标仪上测定490nm波长的吸光度，并计算细胞活力。

2.5 统计学处理

各组药效数据均以均数±标准差（x±s）表示，多组比较用方差分析法处理数据，以P值检验显著性。

3 结果与讨论

3.1 药物浓度范围的确定

如图1所示，5种香豆素类成分在浓度为0.01μmol·L-1、0.1μmol·L-1、1μmol·L-1、5μmol·L-1内无明显细胞毒作用。5种药物选择以上浓度范围可以排除药物对HUVEC细胞的毒性损伤，不会影响细胞存活率，干扰实验结果。因此，以下实验选择0.01μmol·L-1、0.1μmol·L-1、1μmol·L-1、5 mol·L-1剂量组进行实验。

3.2 H2O2浓度的筛选

如图2所示，正常HUVEC细胞生长状态良好，贴壁较牢，细胞呈多角形或短梭形，大小均匀，边界清楚，细胞间连接紧密，呈单层铺路石样镶嵌排列。与正常细胞比较，H2O2损伤后细胞形态发生明显改变，表现为细胞排列紊乱，明显梭形化，细胞边缘模糊，并有明显脱落现象。

如图3所示，采用不同浓度的H2O2损伤后，细胞存活率有不同程度的降低，其中500μmol·L-1 H2O2孵育4h后，可以使HUVEC细胞的存活率降至50.6%，故确定此条件为OSI模型条件。

3.3 药物对氧化应激损伤HUVEC细胞的影响

实验结果表明，H2O2可引起人脐静脉内皮活性降低，与正常对照组比较有显著性差异（P<0.01），各给药组可不同程度地抑制此损伤，在0.01～5μmol·L-1浓度范围内呈剂量依赖关系，即随着药物浓度的增加，细胞存活率升高，结果见表1、图4。

4 小结

近几十年来，HUVEC细胞氧化应急损伤是动脉粥样硬化、高血压和糖尿病等心血管疾病的重要组成部分，预防和治疗内皮OSI具有很重要的临床意义。抗OSI的研究即将成为人类延缓衰老、预防疾病的重要课题[6]。本实验结果表明，5种呋喃香豆素类成分具有一定的抗内皮OSI作用，能够在一定程度上保护HUVEC细胞结构和功能的完整性，进而保护细胞免受过氧化损伤。这个结果为我们进一步研究明党参根皮潜在的防治心脑血管疾病奠定了实验基础。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中国药典（2010年版一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2011：195.

[2]傅立国.中国植物红皮书-稀有濒危植物[M].北京：科学出版社，1991：532.

[3]任东春，钱士辉，杨念云，等. 明党参化学成分研究[J].中药材，2008，31（1）：47.

[4]陈建伟，李祥，武露凌，等. 中国珍稀植物明党参嫩茎叶挥发油化学成分研究[J].天然产物研究与开发，2000，12（3）：48.

[5]顾源远，陈建伟，李祥，等. 明党参果实超临界萃取部位化学成分研究[J].中华中医药学刊，2010，28（1）：75.

[6]Young IS， Woodside JV. Antioxidants in health and disease[J]. J Clin Pathol， 2001， 54（3）：176-186.