有氧运动改善老年脑小血管病大鼠淡漠行为机制的研究

老年人的脑血管疾病是血管性认知障碍最常见的原因之一,最近的研究显示，淡漠是老年脑小血管病(cerebral small vessel disease,CSVD)的主要神经精神症状,且存在于伴有白质病变的病人中。淡漠是一种由情感迟钝、认知和行为减退组成的综合征,通常被认为是认知衰退的一种形式[1]。在大、小鼠中挖穴技能受损及社交能力下降,均被认为是动物的淡漠行为[2-3]。髓鞘是由中枢神经系统少突胶质细胞轴突周围形成的绝缘鞘,在认知功能的发育和维持中起重要作用,炎症和髓鞘损伤可能引起神经精神症状[4]。髓鞘主要分布于白质,接受不成比例的低血流供应和少量的侧支循环,因此,白质特别容易受到缺血性损伤,这种类型的损伤是血管性认知损害的重要特征[5]。各种人类和动物研究表明,体育锻炼可以改善认知功能,但其机制仍不清楚[6]。本研究主要探讨有氧运动是否可以改善小鼠缺血性损伤导致的淡漠行为,为有氧运动改善临床CSVD病人淡漠行为提供根据。

1 材料与方法

1.1 动物模型建立及分组 雄性成年300～350 g的SD大鼠(北京斯贝福实验动物科技有限公司)48只,随机分为4组,每组12只。正常对照组不做任何处理;假手术组仅暴露双侧颈动脉,不进行结扎,在4周后进行4周的游泳锻炼;脑缺血组和游泳组采用双侧颈动脉结扎法(bilateral common carotid artery occlusion,BCCAO)制备大鼠CSVD模型,游泳组在BCCAO术后4周进行4周的游泳锻炼。实验共8周。术前对所有大鼠进行挖穴和社交评价,假手术组和游泳组大鼠于直径80 cm、高90 cm的圆柱形水桶中,1次/d,每次1 h,每周5次,进行为期4周的游泳锻炼。术前和术后8周对4组大鼠进行挖穴和社交评价;之后每组6只用于固蓝染色和免疫荧光染色检测离子钙接头蛋白分子(Iba-1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性星形胶质细胞数目;6只用于Western blotting试验。

1.2 挖穴和社交评估 挖穴的测定参照文献[7]:利用长32 cm,直径为10 cm的塑料水管,一端用纤维板密封,用2个角度为90度的螺丝将管的一端远离地板6 cm高。将塑料水管内填充2500 g沙砾,下午16时开始测试,2 h后将洞穴内剩余的食物称重进行基线测定,然后重新放回笼中,过夜后于次日早晨8时再次进行剩余沙砾的测定。社交行为的测定参照文献[8]:使用一个透明的有机玻璃笼子,大小为46 cm(长)×21.5 cm(宽)×20.5 cm(高),含有1 cm厚的木屑垫料。由21.5 cm×20.5 cm的内壁分成2个相同大小的隔室。内壁的中间底部有一个丝网孔(直径7.6 cm),被2个交叉铁丝线划分成4个相等大小的块,可让受试大鼠进行嗅探,但可防止与隔间正常大鼠的直接接触。受试大鼠和正常大鼠被放置在隔室中10 min。在没有实验者的情况下,在昏暗的房间里进行测试。对动物的行为进行视频记录并评估。嗅探:动物将其鼻子伸入丝网孔并随其晶须移动的持续时间;穿越:动物在测试室中穿过丝网孔的次数。

1.3 髓鞘损伤评估 实验大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,灌流固定,取大鼠基底节区脑组织行常规冰冻切片,厚度为10μm,将切片浸于固蓝染色液中4 h,70%乙醇,碳酸锂分化之后,梯度酒精脱水、二甲苯透明,中性树胶封片,镜下观察大鼠白质束髓鞘损伤情况。

1.4 免疫荧光检测 取冰冻切片通过高温热修复法进行抗原修复,常规画圈,滴加打孔液,10%山羊血清封闭2 h后,加入1∶100稀释的一抗Iba-1(Abcam公司,英国)和1∶250稀释的一抗GFAP(Abcam公司,英国)后：4 ℃过夜,PBS冲洗,滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(碧云天,中国)2 h,PBS冲洗,DAPI染剂15 min复染,10%甘油封片,荧光显微镜下观察。

1.5 western blotting法检测 取大鼠基底节区脑组织用PIPA裂解液匀浆后,12000 r/min4 ℃离心15 min后取上清,加4x蛋白上样缓冲液后,用BCA试剂盒测定蛋白浓度,常规western blotting法检测髓鞘碱性蛋白(MBP)、白细胞介素1(IL-1)、IL-6及肿瘤坏死因子(TNF-α)的蛋白表达水平,以GAPDH为内参组。采用Image J软件计算目的条带灰度值,各组与对照组的百分比用于统计分析。

2 结果

2.1 有氧运动对大鼠挖穴和社交能力的影响 与正常对照组和假手术组相比,脑缺血组大鼠术后4周出现明显的挖穴和社交能力下降(P<0.05)。与脑缺血组大鼠相比,游泳组大鼠挖穴剩余沙砾的质量减少,嗅探时间和穿越次数增加,二者均得到一定的改善(P<0.05)。见表1。

表1 各组间挖穴和社交行为的比较

注:与正常对照组与假手术组比较,*P<0.05;与脑缺血组比较,△P<0.05

2.2 有氧运动对大鼠髓鞘再生的影响 Fast blue染色结果显示,与正常对照组和假手术组相比,BCCAO后4周,脑缺血组的胼胝体和尾状核部位出现髓鞘损伤(包括髓鞘纤维紊乱,空泡形成或髓鞘丢失)。相对于脑缺血组,游泳组髓鞘损伤显著减少。见图1。

2.3 有氧运动对小胶质细胞活化的影响 在假手术组中,大多数小胶质细胞处于静息状态,体育锻炼对假手术大鼠的表型变化没有显著影响。与正常对照组和假手术组相比,脑缺血组中富含更多的Iba-1、GFAP细胞(P<0.05)。此外,相对于脑缺血组,游泳组下调Iba-1、GFAP阳性小胶质细胞的数量(P<0.05)。见表2,图2,3。

图1 有氧运动对CSVD大鼠髓鞘再生的影响(n=6)

组别Iba-1+/mm2GFAP+/mm2MBPIL-1IL-6TNF-α正常对照组13.66±1.9623.83±1.600.56±0.020.54±0.030.58±0.010.57±0.01假手术组14.66±1.0322.83±1.600.57±0.040.56±0.020.57±0.020.56±0.05脑缺血组33.16±1.94∗50.16±5.11∗0.37±0.02∗0.75±0.02∗1.07±0.04∗0.75±0.02∗游泳组组23.16±2.31∗△27.66±2.16∗△0.51±0.03∗△0.62±0.08∗△0.74±0.04∗△0.76±0.03∗

注:与正常对照组和假手术组比较,*P<0.05;与脑缺血组比较,△P<0.05

图2 有氧运动对CSVD大鼠Iba-1活化的影响(n=6)

图3 有氧运动对CSVD大鼠GFAP活化的影响(n=6)

2.4 有氧运动对炎症介质和髓鞘再生的影响 正常对照组和假手术组IL-1、IL-6和TNF-α很少表达,而脑缺血组IL-1、IL-6和TNF-α表达显著增加(P<0.05),MBP表达下降(P<0.05)。体育锻炼增加了MBP蛋白含量(P<0.05),降低了IL-1、IL-6蛋白表达水平(P<0.05),TNF-α各组间表达无明显变化(P>0.05)。见表2，图4。

图4 有氧运动对CSVD大鼠MBP及炎症介质的影响

3 讨论

CSVD引起的慢性低灌注可导致少突胶质细胞的丢失和髓鞘损伤[9]。本研究结果显示，大鼠在BCCAO后8周,LFB染色和MBP蛋白印迹的结果均证实了髓鞘损伤，体育锻炼可改善老年CSVD大鼠的挖穴与社交能力,这是通过降低小胶质细胞的活化,降低炎症反应介质表达,从而减少髓鞘丢失和轴突损伤。在临床研究中发现类似的结果，体育锻炼改善了老年CSVD病人的WM完整性[10]。此外,进行性抵抗体能训练可逆转痴呆前驱症状及轻度认知功能障碍病人的WM高信号进展并改善总体认知功能[11]。已有研究表明,小胶质细胞的活化可以对髓鞘产生破坏并降低髓鞘保护作用[12]。减少小胶质细胞活化可以驱动少突神经胶质祖细胞分化并阻止新生少突胶质细胞凋亡,这是髓鞘再生的重要机制[13]。本研究中,我们发现体育锻炼可以减少Iba-1、GFAP阳性小胶质细胞的表达,此外,体育锻炼通过降低促炎因子(TNF-α,IL-1,IL-6)的蛋白表达来阻止小胶质细胞的活化。与我们的研究结果一致,之前的研究也发现,跑步运动可减轻小胶质细胞的增殖,促进少突胶质细胞形成和髓鞘再生,这与运动诱导的神经发生有关[14]。

脑白质脱髓鞘是人脑退行性改变中主要观察到的细胞变化[15]。通过减少炎症介质的产生及小胶质细胞的活化,维持髓鞘磷脂完整性来促进学习与记忆,提高CSVD病人的生存质量,对于社会及家庭是极其重要的。本实验亦有不足之处,检测大鼠的淡漠行为有一定的局限性,下一步本课题组将尝试在临床上评估老年CSVD病人的淡漠行为,并进行有氧运动的测试,进一步证实本实验的研究结果。