美托洛尔对老年男性非ST段抬高型心肌梗死病人淋巴细胞GRK2表达水平的影响

心衰时β肾上腺素能受体(βAR)信号的丢失与心肌G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)的表达和活性增高有关,是心衰最重要的病理生理机制之一。抑制GRK2的表达可纠正异常的βAR信号系统,从而改善心衰病人的心肌收缩功能。研究表明，β受体阻滞剂能抑制心衰病人GRK2的表达,改善β受体信号系统,进而改善心肌收缩功能和心肌重塑[1]。流行病学证实,缺血性心脏病是导致心衰的主要原因,其中急性心肌梗死演变为心衰的可能性更高。已有临床观察发现，老年急性ST段抬高型心肌梗死病人GRK2水平与其预后相关[2],应用β阻滞剂病人GRK2水平低于未应用者且预后较好[3]。而在老年人群中,急性非ST段抬高型心肌梗死的发病率和死亡率更高。本文旨在探讨美托洛尔对老年急性非ST段抬高型心肌梗死病人外周血淋巴细胞 GRK2 表达的影响,为阻止或延缓心肌梗死演变为心力衰竭、指导急性心肌梗死的治疗提供依据。

1 对象与方法

1.1 对象与分组 新入院、经风险评估后选择药物治疗的65岁以上老年男性急性非ST段抬高型心肌梗死病人80例,依据是否适宜应用美托洛尔分为对照组和美托洛尔治疗组,每组各40例,登记其临床资料。2组病人入院后均予以抗血小板、抗凝、调脂、抗心肌缺血等常规治疗。美托洛尔组经常规治疗病情稳定后,在对照组用药基础上加用美托洛尔6.25 mg,2次/d,持续应用2周后,无明显不良反应者加量为12.5 mg,2次/d。分别于发病24 h内和治疗3、6、12、24个月时行心脏超声检查,并分别抽取外周血检测淋巴细胞GRK2的表达情况。

1.2 方法

1.2.1 心脏功能检测:发病24 h内和治疗3、6、12、24个月时行心脏超声心动图检查,检测其左心室收缩期和舒张期的各项参数,包括左室射血分数(LVEF)、左室舒张末内径(LVIDd)。

1.2.2 主要试剂:人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)、RIzol 及反转录试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)、SuperReal PreMix Plus(天根生化科技有限公司)、GRK2抗体(Cell Signaling Technology)。

1.2.3 外周血淋巴细胞分离:发病24 h内和治疗3、6、12、24个月时采集静脉血,每份2 mL,EDTA 抗凝。将人抗凝静脉血以PBS稀释并混匀,再加至装有淋巴细胞分离液的离心管中,使三者体积比为1∶1∶1;混合液离心(2000 r/min,30 min)分层,小心吸出中间淋巴细胞层,以PBS离心洗涤2次,并计数。

1.2.4 qRT-PCR技术检测GRK2 mRNA的表达:将分离出的淋巴细胞,按照Trizol说明书提取RNA,合成cDNA;qRT-PCR的反应条件:共38个循环,以β-actin 为内参,2-Ct法计算mRNA的相对表达水平。人β-actin 引物:上游5′-AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT-3′,下游5′-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3′;人GRK2 引物:上游5′-GAA CAC ATG CAC AAT CG-3′,下游5′-CCA GGG AGA ACC AGT C-3′。上述引物均由北京赛百胜公司合成。

1.2.5 Western blot检测GRK2蛋白表达:提取分离出的淋巴细胞蛋白,采用BCA法测定蛋白的浓度,调整蛋白浓度后取40μg总蛋白,经SDS-PAGE后,电转蛋白至PVDF膜,用TBST配置的5%BSA封闭3 h,按1∶500比例加入蛋白一抗,4 ℃孵育过夜,TBST洗涤3次后加入HRP标记的二抗(1∶2000),室温孵育1 h。洗涤3次,ECL法显影,ImageQuant_LAS500一体化成像仪成像。Image-J软件对蛋白印迹进行积分吸光度分析,蛋白表达水平用IAGRK2/IAβ-actin比值表示。

2 结果

2.1 2组基线资料比较 治疗前2组间病人的年龄、身高、体质量、入院时的心率、收缩压、LVEF以及LVIDd差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

2.2 2组治疗前后心脏超声指标比较 随着治疗时间的延长,与基线相比,对照组各随访时间点的LVEF水平增高，但差异无统计学意义;而美托洛尔组的增高趋势更加明显:3个月后,美托洛尔组的LVEF值显著高于同期对照组(P<0.05);12个月后LVEF值显著高于基线值(P<0.05)。同时,2组各随访点LVIDd水平与基线相比,差异均无统计学意义;24个月时,美托洛尔组的LVIDd水平显著低于同期对照组(P<0.05)。

表1 2组病人基线资料比较

表2 对照组和美托洛尔组治疗前后超声指标比较

注:与基线比较,*P<0.05;与对照组比较,△P<0.05

2.3 治疗前后外周血淋巴细胞GRK2 mRNA的表达 随着治疗时间的延长,对照组GRK2 mRNA水平逐渐增高,而美托洛尔组GRK2 mRNA的表达则逐渐降低;美托洛尔治疗6个月后,治疗组GRK2 mRNA的表达显著低于基线(P<0.05)及同期对照组水平(P<0.05),见图1。

注：与基线比较,*P<0.05;与同期对照组比较,△P<0.05图1 2组外周血淋巴细胞GRK2 mRNA 的表达情况

2.4 治疗前后外周血淋巴细胞GRK2 蛋白的表达 采用Western blot检测GRK2蛋白表达,结果与GRK2 mRNA变化趋势相似。随着治疗时间的延长,对照组GRK2 蛋白水平逐渐增高,在12个月时显著高于基线(P<0.05),而美托洛尔组GRK2 蛋白的表达则逐渐降低;美托洛尔治疗3个月后,GRK2蛋白表达显著低于基线(P<0.05);6个月后,美托洛尔组GRK2蛋白表达显著低于同期对照组(P<0.05),见图2。

A:Western blot检测GRK2蛋白表达;B: GRK2蛋白相对表达量比较, 注：与基线时比较,*P<0.05;与对照组比较,△P<0.05图2 2组外周血淋巴细胞GRK2蛋白的表达情况

3 讨论

G蛋白偶联受体激酶(GRKs)是一种丝/苏氨酸激酶,可磷酸化激活G蛋白耦合受体胞内域,导致胞内G蛋白偶联信号衰减。在7种GRKs中,GRK2因其在心脏的高表达而对心脏功能具有重要意义。心肌梗死后心肌GRK2表达和活性增强,对心脏βAR有显著的有害作用,可导致βAR脱敏或下调βAR基因的表达[4]。多项研究证实,在急性心肌梗死病人心功能恶化时，淋巴细胞GRK2水平增加[3,5-6]。White等[7]在冠脉结扎心肌梗死兔模型中通过转基因表达β-Arkct后降低了GRK2的表达,20 d后该组动物的心功能显著好于对照组。因此,淋巴细胞GRK2被认为是治疗心肌梗死的一个潜在靶标。

美托洛尔是一种选择性β1受体阻滞剂,临床研究证实其在治疗高血压、心肌肥大、慢性心力衰竭等方面有重要的价值。我们前期的研究证实了老年急性ST段抬高型心肌梗死病人GRK2水平与其预后相关,美托洛尔可降低淋巴细胞GRK2水平，从而一定程度减轻了心功能的丢失[3]。与ST段抬高型心肌梗死相比,急性非ST段抬高型心肌梗死在老年人群中的发病率及致死率更高;且再发率高,对后续心功能的影响更大,病人发展为心衰的概率更高。因此,明确美托洛尔在老年非ST段抬高型心肌梗死中对GRK2表达的影响具有重要意义。

本研究证实,老年急性非ST段抬高型心肌梗死病人在美托洛尔治疗后,GRK2 mRNA和蛋白的表达逐渐降低;在治疗6个月后,GRK2 mRNA和蛋白的表达均显著低于基线和同期对照组。与此对应,因所有病人均应用了心肌梗死标准治疗,所以2组的LVEF均呈恢复趋势;但美托洛尔组LVEF值的增高趋势更加明显,12个月后LVEF值显著高于基线值;而对照组在随访结束时LVEF值与基线值相比仍无显著改善。2组各随访点LVIDd值与基线相比差异均无统计学意义;24个月时,美托洛尔组的LVIDd值显著低于同期对照组。表明长期应用美托洛尔治疗不仅可以改善心功能,还可以延缓甚至逆转左室重塑。

美托洛尔在多种心脏疾病中具有重要作用,但到目前为止,其作用机制仍不完全明了。新近研究证实,除了对βAR的直接阻断、阻止儿茶酚胺诱导的心肌毒性以外,美托洛尔尚可下调GRK2的表达和活性恢复，促进一氧化碳(NO)的合成和释放。Trappanese等[8]在犬二尖瓣反流心衰模型中证实,美托洛尔可促进心脏β3AR信号转导途径恢复,通过提高nNOS活性进一步恢复NO的保护效应。因此,美托洛尔可能较其他β阻滞剂更适用于老年人群;这可能也是本研究中美托洛尔治疗老年非ST段抬高型心肌梗死病人后能够显著改善心功能的重要机制。

尽管本研究证实在老年非ST段抬高型心肌梗死病人中应用美托洛尔可抑制GRK2表达和活性,延缓甚至逆转心肌重构、保留心功能;但临床中,并非所有病人都适合应用美托洛尔。本研究入选病人时,因低血压、心动过缓不能应用美托洛尔者为数不少,有3例在应用后出现头晕、乏力等不适症状而停用。因此,需要积极开发基于下调GRK2且适用于此类病人的新型药物。