马铃薯中多酚氧化酶酶促褐变及防控技术机制研究进展

2022-09-26温雪珊郑煜焱王瑞琪赵晓燕

农产品加工 2022年15期

温雪珊，时月，郑煜焱，王瑞琪，，马越，赵晓燕，4，张超

（1.北京市农林科学院农产品加工和食品营养研究所，北京 100097；2.沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳 110161；3.果蔬农产品保鲜与加工北京市重点实验室，北京 100097；4.农业农村部蔬菜产后处理重点实验室，北京 100097）

马铃薯（Solanum tuberosum L.）属于茄科茄属多年生草本植物，是世界上四大粮食作物之一，与人们的生活息息相关[1-3]。马铃薯在去皮和切割等加工过程中，会与空气接触，发生由酶催化的褐变反应，该反应主要由多酚氧化酶及其底物酚类物质的存在引起。马铃薯发生褐变后，其色泽、风味、质构等特性均会产生变化，并且酶促褐变产生的黑色素或黑色素聚合体不溶于水，不利于人体消化吸收，降低产品的营养价值，甚至有可能影响食品的安全性[4]。研究人员采用低温处理、高温处理和涂膜处理等方式，延缓马铃薯的酶促褐变，并从多个方面揭示褐变形成的机制。但是，针对多酚氧化酶引起的酶促褐变防控技术及其机制综述性总结鲜有报道。

因此，介绍多酚氧化酶的主要特点，着重综述了马铃薯中多酚氧化酶引起酶促褐变的防控技术，并从影响酶促褐变的3个主要方面阐释抑制褐变的机制，为研究马铃薯酶促褐变控制技术的研究者提供技术支撑和参考。

1 多酚氧化酶

1.1 多酚氧化酶的功能和分类

多酚氧化酶又称儿茶酚氧化酶、酪氨酸酶、苯酚酶、甲酚酶、邻苯二酚氧化还原酶，是六大类酶中的氧化还原酶。该酶主要参与生物氧化过程，广泛分布于植物、动物和真菌等细胞内，位于质体膜上，是由核基因编码、多基因控制的一种末端氧化酶[5-6]。

多酚氧化酶可分为3类：单酚氧化酶（酪氨酸酶Tyrosinase，EC.1.14.18.1）、双酚氧化酶（儿茶酚氧化酶Catechol oxidse，EC.1.10.3.2）和漆酶（Laccase，EC.1.10.3.1）。在这3类多酚氧化酶中，儿茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和单酚氧化酶[7]。马铃薯中引起酶促褐变的多酚氧化酶包括单酚氧化酶和双酚氧化酶[8-9]。

1.2 多酚氧化酶的分子结构

多酚氧化酶是由核基因编码，在细胞质中翻译后形成67～70 kDa的前体蛋白，然后由转运肽运送到质体，并且在蛋白酶的作用下加工成为成熟肽，分子量为50～60 kDa。多酚氧化酶蛋白主要由转运肽和2个保守的富含His的铜离子活性中心（CuA和CuB）3个部分组成（图1）[10]。CuA和CuB 2个结合域是多酚氧化酶蛋白活性所必需的，且每个铜离子活性中心分别有3个组氨酸氨基。尽管这2个结合域在不同的植物中高度保守，相比之下CuB较CuA具有更高的变异性，而这种变异可能反映了不同多酚氧化酶对底物的选择性。

多酚氧化酶蛋白结构见图1。

图1 多酚氧化酶蛋白结构

1.3 多酚氧化酶的作用机理

在果蔬正常呼吸作用中，酶促褐变的关键酶不会催化酚类物质、多酚类物质或醌类物质。因此，正常的植物组织细胞即使具备酚类物质、氧气、多酚氧化酶3个条件也不会发生酶促褐变。但是，当植物组织细胞一旦受到去皮、切分等外界损伤性应激，并接触到空气中的氧气时，多酚氧化酶的作用被激活，当酶促褐变的3个条件同时满足时，果蔬将发生酶促褐变反应。反应过程多以2-氨基-3-对羟苯基丙酸为底物，在多酚氧化酶和氧气配合下，催化2-氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸转化为2-氨基-3(3,4-二羟基苯基)丙酸，并进一步催化羟基转化为醌基形成2-氨基-3(3,4-二醌苯基)丙酸。该组分一方面可以自身发生脱水缩合反应形成2-羧基-2,3-二氢-5,6-二羟基吲哚（A），该组分即为黑色素，而该组分化学性质不稳定，其羟基易发生氧化反应，羧基易发生脱羧反应。在氧气和羟基存在的环境中，易发生脱羧反应形成为5,6-二羟基吲哚（B）、5-羟基,6-醌吲哚（C）、5-醌,6-羟基吲哚（D）和5,6-二醌吲哚（E），而且A、B、C和D组分之间还存在相互转化的化学反应，B、C和D组分均为黑色素；在氧气和氢离子存在的环境中，易发生氧化反应形成2-羧酸,5-羟基,6-醌吲哚（F）、2-羧酸,5-醌,6-羟基吲哚（G）和羧酸,5.6-醌吲哚（H），而且A、F、G和H组分之间还存在相互转化的化学反应，F、G和H组分均为黑色素；2-氨基-3(3,4-二醌苯基)丙酸另一方面可能与半胱氨酸的硫基发生缩合反应，醌基还原为羟基形成2-氨基-3(3-S-2-氨基丙酸,4,5-二羟基苯基)丙酸，然后苯环上的氨基与羟基发生脱水缩合反应，形成苯并噻嗪基丙氨酸（I），该组分为黑色素。最终A、B、C、D、E、F、G、H和I组分中的一种或若干种黑色素形成混合黑色素，产生褐变现象[11]。

多酚氧化酶引起酶促褐变形成机理见图2。

图2 多酚氧化酶引起酶促褐变形成机理

1.4 多酚氧化酶的生理功能

马铃薯中多酚氧化酶的功能主要与其抗应激能力有关。研究表明，在马铃薯接受外界应激时，多酚氧化酶的活性及其mRNA表达量均增加、多酚氧化酶转录子集中在受伤部位等，这些研究都提示多酚氧化酶与抗应激有关[12]；同时，多酚氧化酶还可以通过醌共价调节亲核氨基酸形成抗营养机制，抵御昆虫和病原体[13]。还有研究显示，多酚氧化酶可以作为一种氧化还原酶还在光合作用中发挥作用[14]。

2 多酚氧化酶酶促褐变的防控技术

2.1 低温处理

低温处理主要是将果蔬原料在较低温度下贮藏的一种处理，具有设备简单、可控、效果显著等特点，是防控酶促褐变应用最广泛的果蔬保鲜方式。低温处理不仅可以降低多酚氧化酶活性[15]，还可以通过抑制微生物活动降低其腐烂发病率，保持其应有品质，几乎成为所有果蔬贮藏保鲜的首选方式。研究显示，经低温处理后的马铃薯在低温处理（2～4℃）条件下，可以延长货架期3 d[16]；而在低温（15℃）联合防褐变剂处理条件下，在贮藏期第6天后多酚氧化酶活性和颜色变化值最小[17]。刘战丽等人[18]研究发现低温处理（2℃）显著性降低多酚氧化酶活性35%，有效延缓马铃薯褐变。巩玉芬[19]研究发现低温处理（0℃）使马铃薯的货架期达到9 d。

2.2 高温处理

高温处理主要是将果蔬原料在较高的温度环境中放置的一种处理，具有安全、高效等特点，也在果蔬保鲜上得到广泛应用，在抑制多酚氧化酶引起的褐变方面具有明显的效果。姚桂枝[20]研究发现高温处理（45℃热水处理5 min）降低马铃薯褐变度34%。张迎娟等人[21]研究发现高温处理（60℃热水处理1 min）降低了多酚氧化酶和过氧化物酶活性，提高了L*值，减轻了褐变，货架期可达6 d。侯志强[22]研究发现高温处理（45℃热空气处理6 h）的马铃薯在第12天未出现褐变现象。

2.3 气调包装处理

气调包装处理主要是改变果蔬包装内气体组分比例的一种处理，具有抑制多酚氧化酶和苯丙氨酸酶活性，降低果蔬褐变度，延长商品货架期等功能，已广泛应用于果蔬的保鲜贮藏[23]。研究显示，气调包装处理（12% CO2+3% O2+85% N2）抑制鲜切马铃薯多酚氧化酶活性，降低褐变，在贮藏16 d依然具有商品性[24]。赵欣等人[25]研究发现，气调包装处理（40% CO2+50% O2+10% N2）降低鲜切马铃薯片中多酚氧化酶活性78%；采用气调包装处理（51% CO2+15% O2+34% N2）可以降低多酚氧化酶活性53%[26]。

2.4 真空处理

真空处理主要包括真空包装和真空浸渍处理2种技术。真空包装处理可以阻隔环境中的氧气，从而降低果蔬褐变，因此广泛应用于果蔬品质维持领域。徐冬颖等人[27]采用真空包装处理（聚乙烯袋包装）4 d后，鲜切马铃薯的褐变度降低33%。张敏欢等人[28]研究发现，真空包装联合静电场处理显著性抑制鲜切马铃薯酶促褐变现象。蒋元元等人[29]研究发现，真空包装处理（0.05 MPa和0.1 MPa）未对鲜切马铃薯中多酚氧化酶活性产生显著性影响，也不能抑制其褐变现象。真空浸渍处理促进某些组分渗透入果蔬，从而影响多酚氧化酶的活性。张琪等人[30]研究优化真空浸渍曲酸的技术条件，有效抑制鲜切马铃薯多酚氧化酶活性（412 U/mL）。

2.5 高压处理

高压处理具有影响蛋白酶高级结构，钝化多酚氧化酶活性等作用，近年来在果蔬保鲜中被广泛应用[31-32]。韩文娥[33]发现高压处理（500 MPa、10 min）降低鲜切马铃薯丝中多酚氧化酶活性和褐变度，保质期延长至10 d。姜莉等人[34]研究发现，高压处理钝化马铃薯多酚氧化酶和过氧化物酶活性的最佳技术条件是在400 MPa处理40 min，环境的pH值为8.0。索慧敏等人[35]采用高压联合处理（300 MPa处理10 min+1.0%氯化钙）提高马铃薯硬度。陈水科等人[36]研究发现，高压处理抑制多酚氧化酶活性，降低褐变，并且高压处理压力值越大钝化效果越好。

2.6 超声波处理

超声波处理通过空化作用抑制马铃薯的褐变，其机制一般认为超声波的空化作用产生自由基，自由基实现灭酶的作用效果；也有研究人员认为空化作用使蛋白质氨基酸之间的化学键断裂，从而抑制马铃薯褐变。张琪[37]研究，发现超声波处理分别降低鄂薯3号（超声功率720 W，超声时间20 min，温度20℃）和陇薯5号（超声功率540 W，超声时间15 min，温度20℃）多酚氧化酶活性15%和12.74%；杨明冠等人[38]研究发现超声波处理（功率为600 W处理90 min）降低鲜切马铃薯中多酚氧化酶活力至54.21%。王宁馨等人[39]的研究发现超声波处理（25℃下超声功率300 W处理8 min）降低鲜切马铃薯中多酚氧化酶活性24.13%。

2.7 涂膜处理

涂膜处理常采用喷涂或浸渍方式使包材覆盖在果蔬表面，控制果蔬与外界的气体交换，从而达到延长果蔬的货架期。杜传来等人[40]研究发现，海藻酸钠涂膜处理优于卡拉胶膜和壳聚糖涂膜处理，并且降低鲜切马铃薯中多酚氧化酶活性。王娟慧等人[41]研究发现，涂膜处理（0℃，1%的壳聚糖）抑制鲜切马铃薯中多酚氧化酶活性，抑制褐变，其货架期达到6 d。林顺顺等人[42]和王允祥等人[43]优化最佳可食性涂膜处理配方分别为大豆分离蛋白0.2 g/kg，壳聚糖0.15 g/kg，褐藻酸钠0.1 g/kg，以及2.5 g/L维C+6 g/L柠檬酸+1.5 g/L氯化钙，这2个配方可以降低鲜切马铃薯褐变程度。也有研究人员用纳米二氧化钛[44]、不同pH值的羧甲基纤维素钠[45]和百里香精油[46]等涂膜技术处理鲜切马铃薯，均取得不错的效果。

2.8 酸化剂处理

酸化剂处理通过改变体系的pH值，从而影响多酚氧化酶的活性。多酚氧化酶的最适pH值为4.0～7.5，通过使用酸化剂使其偏离最适pH值，抑制多酚氧化酶活性。额日赫木等人[47]研究发现，使用酸化剂处理（1%柠檬酸联合超声功率360 W超声时间7.5 min）可以降低鲜切马铃薯中多酚氧化酶活性。许彬等人[48]研究发现，酸化剂处理（如柠檬酸与氯化钠、抗坏血酸和L-半胱氨酸）可以降低鲜切马铃薯的褐变度。赵明等人[49]研究发现，对5种酸化剂处理抑制马铃薯褐变度的能力依次为草酸＞亚硫酸钠＞乙酸＞柠檬酸＞酒石酸＞没食子酸。王伟等人[50]研究发现，酸化剂处理（50 mmol/L亚硫酸氢钠）第6天鲜切马铃薯片的褐变指数为0.6，并对多酚氧化酶活性抑制作用不可逆。

2.9 基因工程处理

利用基因工程处理可以抑制多酚氧化酶的表达，培育出不易褐变的马铃薯品种。王清等人[51]研究发现转基因品系GD-9-qc-1中马铃薯的多酚氧化酶活性表达不明显，多酚氧化酶活性比对照组降低26.01%～48.65%，褐变度降低40.45%～46.78%。陈亚兰[52]研究发现转基因品系GD-9-qc-44的褐变强度最低仅为3.01，多酚氧化酶活性为4.3 U/g。陈明俊[53]研究发现马铃薯突变体POT32-2和POT32-5中多酚氧化酶活性分别降低20.77%和14.88%。

2.10 氨基酸和酶处理

氨基酸可以螯合多酚氧化酶上的铜离子，从而抑制多酚氧化酶活性。例如，半胱氨酸可以和醌类物质结合生成稳定的无色化合物，从而抑制褐变[54]。Ali H M等人[55]研究发现甘氨酸（＞100 mmol/L）、缬氨酸（＞1.0 mol/L）和苯丙氨酸（＞1.0 mol/L）促进鲜切马铃薯褐变，而低浓度则会抑制褐变。

部分植物的活性成分，如蛋白酶和小分子多肽等，也具有抑制多酚氧化酶活性的功能。赵小芳[56]研究发现不同酶抑制鲜切马铃薯褐变的效果不同（0.4%木瓜蛋白酶＞0.3%菠萝蛋白酶＞0.4%海洋鱼低聚肽＞0.5%海洋鱼蛋白肽），通过响应面设计得到5%无水柠檬酸+0.3%木瓜蛋白酶+0.4%菠萝蛋白酶组合处理鲜切马铃薯褐变度为0.332%，同时也抑制多酚氧化酶活性。

马铃薯酶促褐变防控技术及其效果见表1。

表1 马铃薯酶促褐变防控技术及其效果

3 防控机制

由多酚氧化酶引起的酶促褐变，至少需要以下3个必要：氧气、底物和多酚氧化酶。从现有的多酚氧化酶活性控制的技术来看，化学抑制主要采用含铜试剂和酸化剂等；物理方法主要采用低温、高压和超声波等方法。此外，为了更加有效地控制多酚氧化酶活性，人们还从植物中寻找到一些具有抑制多酚氧化酶活性的天然物质（如果仁糖[57]、皂角苷和三萜系配糖等[58]）。这些天然物质可以抑制多酚氧化酶活性，还避免了化学试剂所引起的污染。

3.1 控制氧气

控制氧气的方法有气调包装处理、真空处理和可食性涂膜处理。通过控制不同气体比例降低氧气浓度，从而抑制马铃薯的酶促褐变现象，延长商品货架期；通过真空包装隔绝外界氧气可以有效降低马铃薯酶促褐变；可食性涂膜通过控制呼吸作用，阻碍氧与酶的接触，有利于产品的保鲜和货架期的延长。

3.2 控制底物

多酚氧化酶在氧气的参与下催化酚类物质生成醌，醌聚合变成了黑色素化合物。酚类化合物化学性质十分活跃，在马铃薯实际加工和实验中控制酶促褐变去底物的方法可能性极小，现实的方法主要从原料的选择、酶活性和氧气的控制等方面入手。

3.3 控制酶

控制酶的方法有高温处理、低温处理和酸化剂处理等技术。多酚氧化酶是一种以铜离子为辅基的金属蛋白，高温易使蛋白质变性，适当的高温可以钝化多酚氧化酶活性甚至使其失活，从而控制马铃薯酶促褐变，适当低温可以有效降低多酚氧化酶活性，从而抑制马铃薯褐变。但需要注意虽然马铃薯的多酚氧化酶活性随着温度降低而受到抑制，但过低温度也会引起马铃薯冷害或冻害情况，因此温度不可一味降低。