益母草悬浮细胞系的建立及转化外源氢醌生成熊果苷研究

罗月芳 唐婕妤 彭菲 谭朝阳

摘要：目的  建立益母草悬浮细胞系，并对其转化生成熊果苷的条件进行优化。方法  以前期实验优选出的愈伤组织为材料建立悬浮细胞系，加入氢醌并培养一段时间后，测定胞内与胞外熊果苷产量，计算转化率。结果  建立的益母草悬浮细胞系分散性良好，通过生长曲线的测定，确定加入氢醌的最佳时期为接种培养的第6日;通过对不同浓度氢醌、不同转化时间的研究，结合熊果苷产生的动力学研究，优选出加入3 mmol/L氢醌转化12 h的熊果苷总产量及胞内产量最高，氢醌转化率也较高。结论  益母草悬浮细胞生长速度快，转化氢醌生成熊果苷的能力較强，有望开发成为新的生物转化体系。

关键词：益母草;悬浮细胞;转化;氢醌;熊果苷

中图分类号：R284.2    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）02-0080-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.02.017

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Abstract： Objective To establish the suspension cell lines of Leonurus japonicus and optimize the conditions for conversion of hydroquinone to arbutin. Methods The suspension cell lines were established based on the callus optimized in the previous study. After hydroquinone was added to it and cultured for a period of time， the intracellular and extracellular arbutin production were determined and the conversion rate was calculated. Results Well distributed suspension cell lines were established. Through the measurement of growth curve， it was determined that the best period for adding hydroquinone was the sixth day of inoculation culture. By studying the different concentrations of hydroquinone and different transformation time， combined with the kinetics of arbutin production， it was preferred to add 3 mmol/L hydroquinone for 12 h， the total arbutin yield and intracellular yield were the highest， and hydroquinone conversion rate was high. Conclusion With the fast growth rate and strong conversion ability， the suspension cell lines of Leonurus japonicus is expected to develop into a new biotransformation system.

Keywords： Leonurus japonicus; suspension cells; transformation; hydroquinone; arbutin

熊果苷又名熊果素，是一种天然存在的糖苷类物质，具有美白、抗溃疡^[1]、抗肿瘤^[2]、镇咳、祛痰、平喘^[3]等作用，因而应用广泛。从植物中提取熊果苷存在技术复杂、效率低、资源依赖性强等问题，比较而言，用植物组织培养方法获得熊果苷更为高效。如彭飞宇^[4]研究表明，通过黄芩毛状根将氢醌合成熊果苷的转化率高达55.6%;彭春秀等^[5]利用白花曼陀罗悬浮培养细胞糖基化外源氢醌合成熊果苷，约有93.4%的氢醌转化合成了熊果苷。

益母草Leonurus japonicus Houtt.为药用草本植物，本课题组在前期研究中已筛选出可用于转化氢醌生成熊果苷的优良愈伤组织^[6]，但愈伤组织不能准确控制接种量，转化效率低，不适合扩大规模的生物反应器培养。因此，本研究利用该愈伤组织建立悬浮细胞系，并进一步优化转化反应条件，对氢醌转化生成熊果苷的动力学进行研究。

1  仪器与试药

Breeze2高效液相色谱仪，美国Waters公司;GZX-450E光照培养箱，天津泰斯特仪器有限公司;SW-CJ-2D双人净化工作台，苏州净化设备有限公司;YXQ-LS-50G立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;电子精密天平，格特勒-托利多仪器（上海）有限公司;TS-2012GZ光照恒温培养摇床，金坛市精达仪器制造有限公司。

熊果苷对照品（批号111951-201301，含量99.6%），中国食品药品检定研究院;氢醌（批号201006131，含量99.0%），四川西亚化工股份有限公司。甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为去离子水。所用材料为湖南中医药大学生物工程实验室前期诱导与筛选出的益母草疏松愈伤组织。

2  方法与结果

2.1  益母草悬浮细胞系的建立

取5 g生长旺盛的疏松愈伤组织，接入含100 mL培养液（MS培养基+0.5 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸+2.0 mg/L 6-苄基嘌呤）的250 mL摇瓶中，转速110 r/min，光照12 h/d，25 ℃培养。按新旧液比为3∶1每隔5 d换液。培养前期每次换液时剔除大的细胞团，待培养至有充分的较小细胞团后，换液时将悬浮细胞液过50目筛，收集滤液，静置片刻待细胞下沉，按新旧液比为3∶1弃去上液并补足新液，继续摇床培养。多次重复，培养一段时间后，建立起益母草悬浮细胞系。此后间歇过50目筛，以维持悬浮细胞的分散性。

在初期悬浮培养中，细胞团块较大，细胞团容易沉淀，静置2 min，悬浮液即清澈透明，换液时弃去大的细胞团。培养一段时间后，静置2 min，大细胞团虽下沉，但悬浮液不清透，有较多小细胞团悬浮其中。延长静置时间，从培养瓶底部向上观察，可见白色的小细胞团。将细胞过50目筛后，由于生物量骤减，细胞生长缓慢。随着培养时间的延长，生物量迅速增加。显微观察可见，细胞团较小，分散度、均一性较好。

2.2  益母草悬浮细胞系生长曲线测定

将益母草悬浮细胞种子液以5 g/100 mL培养液接种至250 mL摇瓶。转速110 r/min，光照12 h/d，25 ℃培养。采用分批培养方式，中途不换液，每日收获3瓶摇瓶，将各瓶悬浮细胞培养液混合于抽滤瓶中，抽滤分离细胞与培养液，测定培养液pH值和悬浮细胞湿重;将收获的悬浮细胞以60 ℃烘干至恒重，测定其干重。

益母草悬浮细胞生长曲线。细胞量的增长情况呈“S”形曲线，延迟期较短;接种后第3日进入对数生长期，细胞分裂活跃，数目迅速增加;第8日进入平台期，生长趋于平缓;第13日后，培养瓶内某些营养物质已耗尽，有毒代谢产物累积，细胞生长逐渐进入衰亡期，生长曲线开始下降。悬浮培养液配制时pH值调节为5.8，灭菌后为5.4。在培养过程中，pH值随培养时间延长和细胞生物量的增加逐渐增大，这可能与益母草次生代谢生成相关生物碱有关，但pH值变化较平缓，最大时仅为5.99，不会影响细胞生长，无需调控。

在分批培养中，第8日进入平台期时，益母草悬浮细胞干重达1.5 g/瓶，為初始生物量（0.3 g/瓶）4倍以上;细胞湿重达32 g/瓶，达初始生物量的6倍。

综上，考虑细胞活力和细胞生物量两方面因素，益母草悬浮细胞培养可选择在接种后第6～8日（接种当日记为第0日）继代或做转化实验。

2.3  熊果苷含量检测

2.3.1  供试品溶液的制备

将收获的3瓶悬浮细胞培养液混合，抽滤，细胞残渣用水清洗3遍，和滤液一起置-80 ℃保存。测定时取出解冻，细胞残渣加10倍量70%甲醇，于80 ℃回流1 h，冷却后补足减失的质量，过0.45 ?m滤膜;培养液即滤液直接解冻后过0.45 ?m滤膜，即得。

2.3.2  对照品溶液的制备

取熊果苷、氢醌对照品适量，精密称定，用甲醇配制成每1 mL含0.05 mg的混合溶液，即得。

2.3.3  色谱条件

采用Ultimate XB-C18（HS）色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（5∶95），检测波长285 nm，流速1.0 mL/min，进样量5 μL，柱温30 ℃。

2.4  不同浓度氢醌和转化时间对益母草悬浮细胞生成熊果苷的影响

以5 g/100 mL接入益母草悬浮细胞种子液，转速110 r/min，光照12 h/d，25 ℃培养。接种后第6日上午同时添加1、3、6 mmol/L氢醌，于12、24、48 h后分批取样，按“2.3”项下方法检测，并计算熊果苷转化率。熊果苷转化率（%）=（转化后培养物中所含熊果苷摩尔数+培养液中熊果苷摩尔数）÷加入培养体系中的氢醌总摩尔数×100%。

相同浓度条件下，随着转化时间的延长，熊果苷在胞内产量逐渐减少，胞外产量增加;1 mmol/L氢醌转化24 h时转化率最高，6 mmol/L氢醌转化48 h时总产量最高。

相同转化时间，随氢醌浓度增加，熊果苷胞外含量明显增大，转化率明显降低;熊果苷总产量随氢醌量增加和转化率降低双重影响而波动，1 mmol/L氢醌转化24 h时转化率最高，达56.32%;6 mmol/L氢醌组转化48 h熊果苷总产量最高，达64.49 mg，但转化率只有13.16%。

2.5  益母草悬浮细胞生成熊果苷的动力学研究

以5 g/100 mL接入益母草悬浮细胞种子液，转速110 r/min，光照12 h/d，25 ℃培养。接种后第6日上午同时添加终浓度2 mmol/L氢醌，摇瓶全避光处理，分批于不同时间取样，按“2.3”项下方法检测熊果苷含量。可见，添加氢醌1 h，即可在细胞内检测到熊果苷;3 h时，培养液中能检测到微量熊果苷;6 h时，胞内熊果苷产量最高，之后持续下降;36 h时，胞内熊果苷产量已基本降到最低值，而胞外产量达到峰值，但此时胞内熊果苷产量并非为0，96 h时仍有部分细胞有活性。

3  讨论

本研究以前期筛选出的疏松愈伤组织为材料建立了益母草悬浮细胞系。悬浮培养第3日进入对数生长期，第8日进入平台期，此时益母草悬浮细胞干重和湿重较初始生物量分别增加了4、6倍，与姜新超^[7]报道百合悬浮细胞增殖结果类似。结果表明，已建立的分散均匀、细胞团颗粒小的悬浮系在旺盛生长期可继代或作为种子液进行扩增培养，以进行下一步的转化实验。

在不同氢醌浓度和转化时间研究中，总体来说，转化时间延长或氢醌浓度增大都会导致熊果苷胞内产量减少、胞外产量增多;氢醌浓度越低，转化率越高，利用度越充分;氢醌浓度越高，熊果苷产出量越多，但转化率下降。综合考虑熊果苷转化率、产量、提取分离成本，认为在3 mmol/L氢醌浓度转化12 h时收获最好，此时熊果苷基本在胞內，熊果苷总产量为58.63 mg，且氢醌转化率较高。胞內浓度高，有利于后期提取分离。

在益母草悬浮细胞转化的动力学研究中，熊果苷总产量在转化6 h时达到峰值，随后以24 h为周期出现波动。由于自添加氢醌起，摇瓶处于全避光状态培养，可以排除光照改变导致熊果苷产量波动。随着转化时间的延长，收获的细胞鲜重减少，培养液体积增多，说明细胞受氢醌毒性死亡，胞液释放，故细胞鲜重持续减少，培养液体积持续增多。推测益母草悬浮细胞在添加氢醌前一直处于光暗交替下培养，带有一定的生理周期，所以在转化合成熊果苷时呈现周期性波动，且外界周期自夜间至晨间时熊果苷产出量高。

综上，随着转化时间延长或氢醌浓度增大，熊果苷以在胞内为主逐渐转变成以胞外为主，最终全部转到胞外;胞内与胞外含量呈明显的消长关联性。结合动力学研究分析其原因，氢醌对细胞有一定毒性，随浓度的提高和时间的延长，导致细胞内溶酶体释放，细胞出现自溶，胞外熊果苷是细胞大量解体将胞内熊果苷释放到胞外的结果。

植物悬浮细胞生物转化的动力学研究迄今少有報道。本研究结果可为其他生物转化研究提供借鉴。利用益母草悬浮细胞系通过生物转化得到熊果苷，可丰富熊果苷的来源途径。

参考文献：

[1] LEE H J， KIM K W. Anti-inflammatory effects of arbutin in lipopolysaccharide-stimulated BV2 microglial cells[J]. Inflamm Res，2012，61（8）：817-825.

[2] LI H， JEONG Y M， KIM S Y， et al. Arbutin inhibits TCCSUP human bladder cancer cell proliferation via up-regulation of p21[J]. Die Pharmazie，2011，66（4）：306-309.

[3] 王慧琛，王丽琴.熊果苷的应用及检测研究进展[J].天津药学，2012， 24（4）：71-74.

[4] 彭飞宇.利用黄芩毛状根生物合成熊果苷工艺研究[D].西安：陕西科技大学，2012.

[5] 彭春秀，龚加顺.白花曼陀罗细胞悬浮培养生物转化外源氢醌合成熊果苷的研究[J].云南农业大学学报，2006，21（4）：429-434.

[6] 唐婕妤，罗月芳，龙靖娴，等.益母草愈伤组织诱导与生物转化能力初探[J].中医药学报，2017，45（2）：50-54.

[7] 姜新超.百合悬浮细胞体系的建立及植株再生[D].北京：中国农业科学院，2010.