艾蒿精油-壳聚糖-VE复合涂膜对冷却猪肉的保鲜效果

徐鑫，陶宏志，吴平华，徐幸莲，韩敏义

(1.六安职业技术学院a.经济管理学院；b.城市建设学院，安徽六安 237158；2.南京农业大学国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，江苏南京 210095；3.安徽省食品药品检验研究院，安徽合肥 230051)

0 引言

冷却肉因具有营养丰富、肉嫩味美、卫生安全等优点深受消费者喜爱，是我国肉类消费的主流趋势，但在0～4℃流通、冷藏、销售和加工过程，很难抑制肉内源酶活性和嗜冷微生物繁殖及氧化作用的影响，容易造成肉腐败变质.因此，对冷却肉采取适当处理，控制其品质，延长货架期是冷却肉产业发展的关键.目前，国内外常用的冷却肉保鲜方法有低温、冰温、微冻、高压技术、气调包装、辐射、化学保鲜和生物保鲜等.随着人们生活水平的提高及人类健康意识的增强，采用广谱、低毒和高效的天然防腐方法来延长猪肉保质期的研究和应用已成为热门课题.

艾蒿(Artemisia argyi H.evl.et Vent)为菊科蒿属多年生草本植物，分布全国各地，在皖南和大别山区广泛种植，为我国中医临床常用药，富含挥发油、黄酮类，同时还含三萜类、多糖、鞣质及微量元素等多种功能性成分，具有杀虫、抑菌、抗氧化、防衰老和抗癌等多种功能[1].周许峰[2]、冯晓慧[3]等研究发现，天然生物提取物分别对SMMC-7721肝癌细胞株、肝癌细胞系HepG2的增殖起抑制和促凋亡功能；孙义玄和包怡红研究发现艾蒿多糖对革兰氏阳性细菌具有很强的抑制作用[4].又艾蒿无毒又可提高食品固有品质的特性，民间将艾叶为原料制作艾酒、艾酱、艾饼和艾叶馒头等食品[5]，但在食品保鲜则鲜见报道；另外，植物精油在不同乳化条件下，可以均匀稳定的分散在以壳聚糖、羧甲基纤维素钠为载体溶液中，是一种理想的涂膜保鲜材料[6].因此，本试验采用天然可食用的艾蒿精油(Artemisia argyi H.evl.et Vent Linn oil，AO)和VE为原料，以壳聚糖(CH)为载体，制得冷却肉艾蒿精油-壳聚糖-VE(AO-CH-VE)复合涂膜液，探讨其对冷却猪肉品质的影响.冷藏第10天根据GB/T22210-2008《肉与肉制品感官评定规范》进行感官评分，用模糊综合评判法对猪肉感官得分进行计算，确定保鲜涂膜材料的最佳配方；然后用最佳复合涂膜处理冷却猪肉与对照组(无菌蒸馏水浸泡处理)比较，每2天分别对冷却肉的复合涂膜组和对照组的pH值、总挥发性盐基氮(total volatile base-nitrogen, TVB-N)、硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid resctive subastances, TBARS)、汁液流失率(drip loss,DL)和菌落总数(Colony Forming Units，CFU)为评价指标，考察艾蒿精油-壳聚糖-VE复合涂膜材料对冷却猪肉的保鲜作用，旨在寻求绿色、高效和实用的天然生物保鲜涂膜剂，为肉及其制品的保鲜和品质提升开辟全新的途径.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪肉：从安徽省西商屠宰厂常规屠宰后3 h内，无菌操作取霍寿黑毛猪后腿肉，修去筋腱，无菌薄膜包装迅速转运到实验室待用；艾蒿：2018年6月采自安徽泾县茂林镇铜山村生态林内野生种类，经课题组研究团队鉴别为菊科植物艾蒿，去掉死叶，通风阴凉处自然风干后，取茎叶，用高速组织粉碎机粉碎，过80目筛密封2℃保存备用；1410黑色聚丙烯托盘(PP)：食品材质PP料(QS质量认证),14cm*10cm*2cm，台州市路桥晨亨塑料厂；食品级保鲜膜(PE)：30cm*20m，广州市亚厨日用品有限公司；α-壳聚糖：CH，脱乙酰度≥90%，分子质量282kD，南通兴成生物制品厂 ； VE：食品级，纯度≥98%，郑州福润德生物工程有限公司；乙酸：食品级，含量≥99.8%，天然度≥95%，邹平县台子福利醋酸加工厂；双氧水：南京建成生物工程研究所；食用酒精、柠檬酸、甘油：广州化学试剂厂；其它试剂为分析纯或化学纯.

1.2 仪器与设备

超净工作台：SB-IS-1A型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；UV-2450型紫外可见分光光度计：日本岛津公司；电子天平：JA2003型，上海精密科学仪器有限公司；HH-6型数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；Agilent1200高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；TD3C800B离心机、索式提取器：湖南研科生物有限公司；旋转蒸发仪：RE-5299,上海亚荣生化仪器厂；NJL07-3型实验专用微波炉：南京杰全微波设备有限公司；电热干燥箱：GZX-RH202型，上海市跃进医疗器械一厂； pH仪: 雷磁PHBJ-260型，上海精密仪器仪表有限公司;半微量凯氏定氮仪：广州仪器厂；DFY-250A高速组织粉碎机：上海比朗仪器有限公司；80～90目筛、天平、铁架台、漏斗、滤纸、圆底烧瓶、锥形瓶、玻璃缸、烧杯、玻璃棒等.

1.3 方法

1.3.1 肉样处理

将运回实验室霍寿黑毛猪后腿肉经检疫合格后，无菌操作踢去筋膜及多余的脂肪，浸入30%食品级H2O2中20s灭菌，取出用3倍肉样重量的无菌水清洗其表面后，用徐鑫，韩敏义[7]等二段式冷却法充分排酸24h后，用消毒过刀具和案板等工具切成小块((100±10)g)，共30块，随机分成10组，每组3块.

1.3.2 艾蒿精油的提取

称取艾蒿粉600 g置于圆底烧瓶中→加入无水乙醇1000 ml→80℃温水浴中索式提取→艾蒿提取物在圆底烧瓶中富集(8次重复)→蒸馏除去挥发油中的乙醇→得到艾蒿精油2.9mL(约0.5%提取率)→密封置于冰箱冷藏室控制(4±0.5)℃中保藏备用[7].

1.3.3 艾蒿精油-壳聚糖-VE复合涂膜液的制备

量取10 mL冰醋酸溶于蒸馏水中，配制体积分数1%醋酸溶液.以1%的醋酸溶液为稀释液，分别按表1所示添加一定量的艾蒿精油、壳聚糖和VE后，分别于50℃、300W功率下超声处理10min后，用磁力搅拌棒搅拌使溶剂完全溶解并均匀混合后，采用0.15MPa、121℃、15min的高压蒸汽灭菌，冷却至室温密封放入冰箱控制(4±0.5)℃冷藏备用.

1.3.4 艾蒿精油-壳聚糖-VE复合涂膜处理试验设计

根据前期试验结果，采用艾蒿精油、壳聚糖和VE为试验因素，取值水平分别为0.25～1.00%、0.30～0.5%、0.05～0.15%，选取L9(33)正交试验，优化复合保鲜剂配比.

将肉样分别置于复合保鲜剂浸泡液中浸渍3min，取出自然沥干保鲜液3～5min左右，同时以无菌蒸馏水浸泡处理的肉样作为对照组，以艾蒿精油、壳聚糖和VE最佳配比的复合保鲜剂浸泡处理的肉块作为验证组.以上各组肉块均装入消毒过的聚丙烯托盘，用保鲜膜封口置于(4±0.5)℃冰箱冷藏，每2天取样测定每组菌落总数(Colony Forming Units，CFU)、pH值、总挥发性盐基氮(total volatile base-nitrogen, TVB-N)、硫代巴比妥酸值(thiobarbituric acid resctive subastances, TBARS)和汁液流失率(drip loss,DL)等指标,每个试验3次重复取均值，第10天进行感官评定，以评价艾蒿精油复合剂对冷却肉品质变化的影响.

表1 正交试验因素水平表

1.4 艾蒿精油-壳聚糖-VE(AO-CH-VE)复合涂膜保鲜剂对冷却猪肉保鲜效果的测定

1.4.1 冷却肉感官评定标准

本研究按GB/T22210-2008《肉与肉制品感官评定规范》进行感官评分，挑选有一定的专业基础、感官评价经验和无生理缺陷教师与学生共10名，从猪肉色泽、气味、组织状态和滋味4个方面分别评分.每项指标分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、V(即新鲜、较新鲜、一般、较差、差)等5个等级进行评价，评分标准: 10～9分，Ⅰ(肌肉有光泽、颜色鲜红、气味正常、柔软弹性好、无汁液流失、肉汤鲜香) ; 9～8分，Ⅱ(肌肉颜色稍暗、有光泽，鲜味淡、无异味，少量汁液流失，弹性较强，肉汤较香);8～7 分，Ⅲ(颜色暗红，汁液流失较多，肉汤不香，弹性弱);7～6 分，Ⅳ( 肉表面 1/3 变褐色，略有异味，无弹性，汁液流失多，肉汤浑，有异味);6～5分，V(肉表面大部分变褐色，有明显异味，无弹性，汁液大量流失，肉汤变色，异味重).

1.4.2 冷却肉感官质量的模糊综合评价

1.5 冷却猪肉理化指标测定

1.5.1 菌落总数(Colony Forming Units，CFU)的测定

参照GB/T4789.2-2016规定稀释平板倾注计数法每 2d 测定一次，结果以lg( CFU，Colony Forming Unit) 计，肉样检测指标超标后实验终止.

1.5.2 pH值的测定

使用上海雷磁PHBJ-260便携式PH计按GB /T 5009.237- 2016规定方法测定.

1.5.3 挥发性盐基氮( Total Volatile Basic Nitro-gen，TVB- N)的测定

参照 GB/T 5009.228-2016 规定，采用半微量凯式定氮法进行，结果大于20mg/100g判定为品质超标.

1.5.4 硫代巴比妥酸值(Thiobarbituric Acid Reactive Substances, TBARS) 的测定

参考吕永平和徐鑫[7]的方法测定TBARS 值.

1.5.5 肉样汁流失率(drip loss，DL)的测定

涂膜晾干后的肉样重量为(w0)，每 2d 从保鲜模封口的聚丙烯托盘中取出肉样，用杀菌过的滤纸轻轻擦干肉样表层汁液后称重(wt) .其汁流失率(DL):

1.6 数据统计与分析

试验设3个平行，取平均值.数据统计分析利用SPSS 22.0软件处理，结果以均数±标准差(±s)形式表示，显著和极显著差异P分别小于0.05和0.01；采用Excel2007作试验数据图.

2 结果与分析

2.1 正交试验结果分析

以艾蒿精油、壳聚糖、VE添加量为因素，第10d按1.4.1的感官评定标准对冷却猪肉的感官质量评分，按1.4.2方法对冷却猪肉的感官质量评分计算出模糊综合评价结果，见表3.

由表3可知，影响冷却猪肉感官质量因子的主次顺序为艾蒿精油(A)、壳聚糖 (B)、VE(C),艾蒿精油(A)>壳聚糖(B)> VE(C)，优化组合为，即艾蒿精油0.50%，壳聚糖0.40%，VE0.10%.

针对优化条件进行验证实验，10d时冷却猪肉的感官模糊综合评判得分为8.75分，属于Ⅱ级，其结果优于其它组别配伍试验.

表2 L9(33) 正交试验结果

2.2 艾蒿精油-壳聚糖-VE复合涂膜保鲜剂对冷却猪肉保鲜效果

2.2.1 菌落总数(Colony Forming Units，CFU)的变化

菌落总数是判断食品被微生物污染程度和卫生质量优劣的重要指标，故菌落总数直观地反映冷却肉品质变化情况.由图1可知，两组菌落总数随冷藏时间的延长均有不同程度的增加.在0～2 d，对照组菌落总数增长缓慢与艾蒿精油-壳聚糖-VE复合涂膜组的菌落总数值差异不显著(p>0.05)；2天后对照组菌落总数增长速度显著快于艾蒿精油-壳聚糖-VE复合涂膜组(p<0.05)，第4天就达到3.59(lg(CFU/g)，菌落总数已接近国家标准限定值4.00(lgCFU/g)；艾蒿精油-壳聚糖-VE复合涂膜组微生物的生长繁殖缓慢，第12天菌落总数达到3.72(lg(CFU/g))，接近国家标准限定值.说明艾蒿精油-壳聚糖-VE复合涂膜组能有效地抑制微生物的生长繁殖.孙义玄和包怡红等[4]分别运用不同方法得到艾蒿精油在低温下对生长繁殖革兰氏阳性的葡萄球菌属(Staphylococcus)，兼性厌氧的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等微生物有很强的抑制作用，由此推测艾蒿精油-壳聚糖-VE涂膜能延缓冷却猪肉冷藏期间菌落总数的上升，可能与其对大肠杆菌的抑制有关.

图1 冷却肉冷藏过程中菌落总数的变化

2.2.2 pH值的变化

pH值是评价猪肉新鲜变化的重要指标.猪肉屠宰后经僵硬到自溶的冷却阶段pH值由中性降到图2的5.81，随冷藏时间的不断延长，冷却猪肉的肌动球蛋白离解为肌球蛋白与肌动蛋白，可能又受革兰氏阴性菌污染和酶的作用下，蛋白质被分解为氨和胺类化合物等碱性物质，两组样品的pH值都在增加.对照组的pH值快速上升，第6天达6.48接近6.76的变质肉标准；而艾蒿精油-壳聚糖-VE复合涂膜组pH值前期下降然后缓慢上升，到第12天达6.32还未达到变质肉pH>6.76标准，与对照组比较，pH变化差异显著(p<0.05).说明艾蒿精油-壳聚糖-VE复合涂膜组能有效阻止猪肉冷藏过程中的的自溶腐败，达到较好的保鲜效果.

图2 冷却肉冷藏过程中pH值的变化

2.2.3 TVB-N的变化

总挥发性盐基氮( TVB-N)是判断肉类新鲜程度的客观指标，并与感官变化一致.从图3可知，随着冷藏时间的不断延长，冷却肉对照组和艾蒿精油-壳聚糖-VE复合涂膜组的样品在微生物和酶的作用下，TVB-N值变化趋势大致一致.但在冷藏2d前，对照组和精油-壳聚糖-VE复膜组间TVB-N值无显著差异(P>0.05)；第 3d 时，对照组上升较快，第6天达19.97mg/100 g，已接近变质肉20 mg/100 g的标准，而艾蒿精油-壳聚糖-复合涂膜组在第12天TVB-N值14.89mg/100 g≤20 mg/100 g，仍在二级鲜肉的范围内，上升速度明显慢于对照样(p<0.05).由此推测，复合膜具有良好的阻止外界环境氧气和水分的影响，能显著抑制冷却肉中内源酶活性和腐败菌的生长繁殖，从而延缓蛋白质分解氨(NH3)及胺类(RCH2NH2)等碱性含氮挥发性物质.以上验证，艾蒿精油-壳聚糖-VE复合涂膜组延长冷却肉的货架期.

图3 冷却肉冷藏过程中TVB-N含量的变化

2.2.4 硫代巴比妥酸反应物值(TBARS)的变化

TBARS值是表征含脂肪类物质脂肪二级氧化产物的多少，是评价脂肪氧化酸败程度的重要指标.从图4可知，对照组和艾蒿精油-壳聚糖-VE复合涂膜组随着冷藏时间延长，冷却猪肉TBARS值均呈上升趋势，变质和产生异味的冷藏天数，CK组在第6 d为0.71mg/kg>0.50mg/kg；艾蒿精油-壳聚糖-VE复合涂膜组第10 d为0.69mg/kg>0.50mg/kg，两者之间差异显著(p<0.05), 验证艾蒿精油-壳聚糖-VE复合涂膜组能有效抑制冷却肉冷藏期间的脂质物质氧化酸败，控制肉样内源酶活性和腐败菌繁殖，延长其货架期.研究结果与刘占东和李璐等[8]研究的肉桂精油在一定程度上抑制冷却肉脂肪氧化相一致，原因可能植物精油富含多种抗氧化活性成分，对细菌具有抑制作用，对DPPH自由基和羟自由基具有很强的清除能力有关[9].

图4 冷却肉冷藏过程中TBARS值的变化

2.2.5 汁液流失率(DL)的变化

肌肉汁液流失率程度直接影响肉的营养成分、色香味、嫩度等食用品质.由图5可知，对照组和艾蒿精油-壳聚糖-VE复合涂膜组随着冷藏时间延长，冷却猪肉汁液流失率皆呈上升趋势.可能原因是冷却猪肉在冷藏期间细菌生长繁殖造成肉组织结构收缩与肌肉蛋白质胶体发生了不可逆变化，致使肌肉持水性降低，凝胶组织中水分流出.对照组冷藏6天冷却肉汁液流失率为9.64%，而艾蒿精油-壳聚糖-VE复合涂膜组冷藏12天汁液流失率仅为6.32%，两者之间差异显著(p<0.05).说明艾蒿精油-壳聚糖-VE复合涂膜组抑制猪肉组织膜脂氧化作用[10]，显著降低冷却猪肉的细胞膜的通透性，提高肉样保水性.可能原因是壳聚糖在肉样形成薄膜阻止肉样与外界环境中氧气和腐败微生物的接触，又壳聚糖、艾蒿精油和VE协同抑制肉样腐败微生物活动和繁殖，双方耦合抑制了肉样蛋白结构的变形与破坏，从而降低肉样汁液流失[11].

图5 冷却肉冷藏过程中汁液流失率的变化

3 结论与讨论

3.1 艾蒿精油-壳聚糖-VE复合涂膜组对冷却猪肉具有显著的保鲜效果，通过模糊数学综合感官评价，得出最佳复合涂膜液配比为艾蒿精油0.50%(v/v)、壳聚糖0.40%(m/v)、VE0.10%(m/v).能有效延长冷却猪肉货架期.

3.2 冷却猪肉的艾蒿精油-壳聚糖-VE复合涂膜组与对照组相比，3d后冷却猪肉冷藏猪肉的复合涂膜组CFU、pH值、TVB-N、TBARS、DL与对照组之间差异显著(P<0.05)，其第10d冷却猪肉的复配组的感官模糊综合评判得分为8.75分，属于Ⅱ级.

3.3 本试验研制了在天然涂膜材料壳聚糖溶液添加天然抗氧和抑菌剂艾蒿精油和VE对冷却肉涂膜，降低冷却肉中内源酶活性，减缓微生物活动，提高了冷却肉冷藏的保鲜效果，延长其货架期.由此推测，天然生物保鲜剂在冷却肉涂膜保鲜中具有良好的应用前景.

艾蒿为药食两用植物，全国各地盛产丰富，安全无毒，富含多种活性成分，抗氧化防腐效果显著，用于冷却肉保鲜切实可行，解决肉和肉制品在流通过程中腐败变质问题；艾蒿精油提取和对肉保鲜处理简单便捷、易掌握，与丁香、肉桂和白薇等其它具有抗菌和抗氧化性能的天然植物相比，价格低廉，是规模化生产冷却肉天然植物精油涂膜保鲜优选之一.为使艾蒿精油后期更好应用于肉类保鲜生产中，项目后期继续深入研究艾蒿精油的活性成分抗菌和抗氧化机理；进一步探讨艾蒿精油复合涂膜结合气调、辐射、纳米、冷杀菌、冰冻和微冻等其他保鲜手段，对冷却肉品质的影响，弥补单一保鲜方法不足，更好发挥综合保鲜优势.