基于低场核磁共振研究不同解冻方式对冻猪肉食用品质的影响

程天赋，蒋 奕，张翼飞，赵茉楠，俞龙浩,2,*

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江省中加合作食品研究发展中心，黑龙江 大庆 163319）

肉类的多种营养成分可为常见食源性病原体和食品腐败菌生长繁殖提供理想的环境，导致肉类非常易腐[1]。在全球肉类出口市场中，冷冻是一种被广泛接受的能够保证食品安全的食品保鲜方法，肉类商品化需要冷冻，与鲜肉相比，冷冻肉可以长期保存，运输成本和价格更低[2]。冷冻使肉的温度下降至冻结点以下，此时微生物及其周围介质中水分被冻结，细胞内水分结冰形成冰晶扰乱了原生质胶体状态并对原生质膜与细胞壁的结构产生机械破坏，这些内外环境的改变导致微生物代谢活动受阻或致死。然而，与新鲜肉类相比，冷冻/解冻的肉类通常被认为质量欠佳。冷冻肉的质量损失程度取决于多个因素，包括冻融速率及解冻方法等[3]。有研究表明鲜肉在冻结和冷冻保存期间会受到冰晶体和蛋白质变性引起的细胞损伤的影响，导致肉的食用品质下降[4-7]。冷冻肉需要在任何后续的加工或烹饪之前进行解冻，解冻过程中需要尽可能恢复肉类原来的品质，解冻方法包括水解冻、冷藏解冻、微波解冻、超声解冻和高压解冻等[8]。

肉类在冻结和解冻过程中品质变化的实质是温度影响肉中水和蛋白质。在肉类中，水也被称为肌水，其被包裹在肌原纤维蛋白质网络中，其分布和流动性与肌原纤维蛋白质网络的结构特征高度相关[9]。近些年的研究报道表明，核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）弛豫时间测量法可以用来表征食物的主要成分之一——水的分布和流动性。特别是低场核磁共振（low field-NMR，LF-NMR）T2弛豫时间已被用于研究肌水分配和肌水在肉中的流动性[10]。不同肉制品中T2分布的改变反映了不同产品的蛋白质结构发生化学交换的不同水分区域和水分流动性[11-12]。本研究利用LF-NMR检测技术探究冻猪肉在不同解冻方法下其肌水与食用品质间的关联性。

本实验的目的是结合LF-NMR T2弛豫技术分析解冻过程中肌水的分布及流动性与肉食用品质之间的联系，比较不同解冻方式下肉食用品质指标的变化情况，包括嫩度、色泽、蒸煮损失、持水能力（water holding capacity，WHC）、风味、多汁性等，探究在不同解冻方式下肌水对肉食用品质影响的差异性。因此，本实验旨在从肌水对解冻猪肉食用品质的贡献率的角度筛选出最佳解冻方法，为解冻技术的研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

冷鲜肉（半腱肌（宰后于4 ℃放置27 h））购自双汇冷鲜肉专柜。

1.2 仪器与设备

NMI20-15 NMR食品成像分析仪 苏州纽迈分析仪器股份有限公司；TA-XT Plus质构仪 英国Stable Micro Systems公司；KP-21型求积仪 日本Koizumi公司；CR-410色差仪 日本Konica Minolta公司；TR-52i温度记录仪、TR-5230温度探针 日本T&D公司；PH-STAR胴体pH值直测仪 德国Matthaus公司；FA25乳化均质机 德国Fluko公司；Specord210 plus紫外-可见分光光度计 德国耶拿分析仪器有限公司；5417R离心机德国Eppendorf公司；G80F23CSL-G1（S0）微波炉格兰仕微波炉电器有限公司；BCD-439wkk1FYM电冰箱海信容声（广东）冰箱有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肉样品预处理及分组

将冷鲜猪肉剔除筋膜修型后置于6 cm×6 cm×13 cm的模具，共36 份肉样，每份500 g。取9 份鲜肉肉样作为对照，其余27 份肉样插入TR-5230温度探针后置于-25 ℃冰箱冷冻24 h（探针沿模具中轴线垂直于底部插入，插入深度为6.5 cm）。分别用于冷藏解冻及两种微波解冻。利用TR-52i温度记录仪监测解冻过程中肉样的温度变化，当肉样核心温度达到0 ℃视为解冻完成。本实验的两种微波解冻程序是参照高文宏等[13]的研究方法，并在其基础之上进行适当修改，即微波-1（750 W）解冻（13 s-20 s-13 s-20 s-13 s-20 s-13 s-20 s-18 s-26 s-7 s-26 s-7 s-26 s-7 s-26 s-7 s-26 s-7 s-26 s）和微波-2（750 W）解冻（13 s-20 s-13 s-20 s-13 s-20 s-13 s-20 s-13 s-20 s-13 s-20 s-13 s-20 s-8 s-26 s-7 s-26 s-7 s-26 s-7 s-26 s-7 s-26 s-7 s-26 s-7 s-26 s-1 s）（其中20 s和26 s是微波间歇时间，其余为微波工作时间），分别解冻9 份冷冻肉样。剩余9 份冷冻肉样置于4 ℃冰箱进行冷藏解冻。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 温度测定

利用Recorder for Windows软件将冷藏解冻中的温度记录仪设定为每10 min进行一次温度记录；将微波解冻中的温度记录仪设定为每5 s进行一次温度记录。当肉样核心温度达到0 ℃时终止解冻，测定其他指标。

1.3.2.2 pH值测定

将pH值直测仪探头插到各解冻完成肉样的中心部位测定pH值，每个肉样品重复3 次测量。

1.3.2.3 色泽测定

采用CR-410色差仪测定肉样切面的L*、a*和b*值，每个肉样品重复3 次。

1.3.2.4 WHC测定

通过滤纸压制法一式3 份测定WHC。称300 mg肉样品，并使用实验室压机在两个有机玻璃板之间以36 kg/cm2压制3 min。使用求积仪测量压制水和肉样品的面积。WHC按式（1）计算，每个肉样品重复测定3 次。

1.3.2.5 解冻损失率测定

将肉样在解冻前称质量（m1/g），解冻后用滤纸吸干肉块表面水分再称质量（m2/g），按公式（2）计算解冻损失率，每个肉样品重复测定3 次。

1.3.2.6 蒸煮损失率测定

从各组肉样中切取300 g，放入塑料袋并标记组号，水浴加热至中心温度75 ℃，保持30 min，然后取出冷却至室温，用纸巾将肉样表面水吸干后称质量，蒸煮损失率按公式（3）计算，每个肉样品重复测定3 次。

1.3.2.7 水溶性蛋白含量测定

在各组肉样中各取5 g于50 mL离心管中，分别加30 mL蒸馏水，在14 000 r/min下均质2 min后在1 500×g下离心10 min，取上清液用Biuret法测定水溶性蛋白含量。每个肉样品重复测定3 次。

1.3.2.8 盐溶性蛋白含量测定

将抽出水溶性蛋白后，向离心残渣中加入质量分数3% NaCl 30 mL，在14 000 r/min下均质2 min后在1 500×g下离心10 min，重复3 次后取上清液用Biuret法测定盐溶性蛋白含量。每个肉样重复测定3 次。

1.3.2.9 剪切力测定

本实验采用Warner-Bratzler法测定肉样品的剪切力。TA-XT Plus型质构仪参数设置为：测试速率5 mm/s，触发力5 g，载物质量30 kg。每个肉样品重复测定3 次。

1.3.2.10 LF-NMR T2弛豫时间的水分分布

将肉样品放置在与纤维方向垂直的圆柱形核磁管（直径14 mm、高20 cm）中，放于直径为18 mm的NMR探头上，在23.2 MHz的共振频率下使用CPMG序列测量横向弛豫时间T2。经过16 次扫描重复获取4 096 个回波数据，拟合0.01～3 000 ms的弛豫时间。

1.3.3 感官评价

参考Su等[8]的感官评定方法，根据外观、风味、质地、味道和整体可接受性进行评价。将肉样品切成1 cm厚度，并使用电烤箱加热直到肉的核心温度达到75 ℃后，15 名评定员以9 分为标准进行肉样品的感官评价。得分由1 分（非常差）到9 分（非常好）。

1.4 数据统计分析

每个指标重复测定9 次，运用SPSS 20.0软件比较平均值对实验所得数据进行单因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）、最小显著差数法（least significant difference，LSD）分析、Duncan检验多重比较以及相关性分析。

2 结果与分析

2.1 解冻过程中的温度变化情况

图1 不同解冻方式下的肉样核心温度变化曲线Fig. 1 Curves of internal temperature for meat samples subjected to different thawing methods

当解冻肉样的核心温度恒定在0 ℃时视为解冻完成，此时终止解冻。由解冻肉样的核心温度变化曲线（图1）可知，冷藏解冻时间是微波解冻时间的100～200 倍，微波解冻可以有效地减免肉在冷藏解冻过程中发生的脂质氧化、蛋白质氧化、蛋白质变性和微生物生长等肉品质恶化的问题[14-15]。此外，从解冻肉样的温度变化曲线可以看出，当温度接近于-1.5 ℃时解冻速率极为缓慢，这是因为肉的冰点温度在-1.1～-1.4 ℃之间，当温度低于冰点时，冻结肉的组织状态为冰晶与细胞的混合物，当温度达到冰点时，冻结肉中的冰晶融化，肉样组织状态变为冰、水和细胞三者的混合物，而细胞与冰晶两者混合物的导热系数大于细胞与水、冰晶三者混合物；并且就肉样组成的最小单位细胞而言，当温度接近于冰点时，细胞内的冰晶部分融化成水，细胞导热系数也会降低；因此当解冻温度到达冰点附近时，冻结肉的导热系数降低，解冻速率显著下降[16]。

2.2 不同解冻方式对猪肉食用品质特性的影响

表1 不同解冻方式对猪肉食用品质的影响Table 1 Effects of different thawing methods on pork quality

由表1可知，解冻方式对肉样的解冻损失率和蒸煮损失率具有极显著影响（P＜0.01）。微波解冻肉样的解冻损失率和蒸煮损失率相比于冷藏解冻肉样显著降低。其中冷藏解冻的解冻损失率最高，微波-2解冻的解冻损失率最低，二者相差约2.11%。这与Lee[17]的研究结果一致，其研究表明微波解冻的解冻损失比冷藏解冻低。同时Kondratowicz等[18]的研究结果表明微波解冻猪肉解冻损失率少于室温解冻。冷藏解冻的蒸煮损失率最高，微波-1解冻的蒸煮损失率最低，相差约7%。与鲜肉相比，微波-2解冻肉样的蒸煮损失率显著增加（P＜0.05），而微波-1解冻肉样却极显著降低（P＜0.01），这可能是随着微波功率的增加，肉块中心部位水分子运动更剧烈造成的。微波-2解冻肉样的WHC（30.99%）与鲜肉（30.57%）无显著差异，其他两种解冻肉的WHC均极显著低于鲜肉（P＜0.01）。值得注意的是，两种微波解冻肉样的WHC均极显著高于冷藏解冻肉的WHC（P＜0.01）。刘燕等[19]认为冷藏解冻会出现上层肉已解冻而汁液流到下层遇到冷肉又结成冰的情况，这样会破坏下层肉的肌肉组织，导致解冻不均衡、肉汁流失量大等问题的发生。由此可知，快速微波解冻可以有效缓解在解冻过程中冰晶对细胞壁的破坏，有利于肌肉组织对水分的保持。因此，本研究结果表明相比于冷藏解冻，微波解冻更有助于维持肉的品质。

对于消费者而言，肉的颜色也很重要。肉的颜色主要取决于肉中还原型肌红蛋白（myoglobin，Mb）、氧合型肌红蛋白（oxygenated myoglobin，MbO2）和高铁型肌红蛋白（metmyoglobin，MMb）三者所占的比例[20]，MbO2含量越高a*值就越大，肉色越好，而MMb含量越高b*值就越大，肉色越差。在本实验中，3 种解冻肉样的L*、a*、b*值相比于鲜肉均发生极显著变化（P＜0.01）（表1）。各解冻肉样的L*值均极显著低于鲜肉（P＜0.01），表明解冻过程可降低肉样的亮度，这与Galobart等[21]针对冻融及烹饪过程对鸡胸肉L*值影响的研究结果一致。各解冻肉样的a*值均极显著低于鲜肉（P＜0.01），其中微波-2解冻肉的a*值与鲜肉最为接近，微波-1解冻与冷藏解冻肉样的a*值无显著差异（P＞0.05）。这可能是解冻过程中肌红蛋白随着解冻渗出液流失造成的，肌红蛋白是水溶性肌肉蛋白，存在于肌浆蛋白中。3 种解冻肉样间b*值差异极显著（P＜0.01），且3 种解冻肉样的b*值相比于鲜肉均极显著降低（P＜0.01），其中冷藏解冻肉的b*值最低，仅为4.84。因此，结果表明解冻过程会导致肉的光泽性变差，但微波-2解冻肉的肉色更接近于鲜肉。

pH值可以在一定程度上反映肉的保水性、嫩度等[22]。但在本实验中解冻后肉的pH值没有发生显著变化（P＞0.05）。各肉样的pH值均在5.4～5.7这一范围内。有两种情况可以解释这一现象：一是肉样在冻结之前已完成糖酵解作用；二是冻结使糖酵解酶活性降低[1]，使其进入休眠状态进而终止糖酵解作用。而本实验选购的猪肉是经正规商业屠宰程序宰杀后在4 ℃条件下存放27 h的冷鲜肉，说明实验肉样在冻结之前已完成僵直，即肉样在冻结前就已经达到极限pH值，因此肉样不会发生解冻僵直收缩现象，这与剪切力结果相对应。

嫩度是一个非常重要的肉品食用指标，而肉的嫩度通常与肉剪切力呈负相关，剪切力越小说明肉越嫩度越好。结果显示，3 种解冻肉样的剪切力差异显著（P＜0.05）（表1），其中微波-1解冻肉样的剪切力最低（18.51 N），嫩度最好。同时，解冻肉样的剪切力相比于鲜肉极显著降低（P＜0.01）。这与前人的研究结果[23-24]一致，其对这一结果的解释为：当达到冰冻温度时，牛肉中钙蛋白酶活性保持相对稳定，且肉的冷冻和解冻会增加钙蛋白酶在成熟过程中的蛋白水解活性，从而增加肉嫩度。此外Grayson等[25]的研究结果同样证明了冷冻和解冻会增加LL和ST牛排的嫩度，他们认为冻结并不影响融化过程中发生的蛋白水解。而Liu Zelong等[26]认为剪切力的降低归因于冰晶形成导致了膜强度的损失，从而减少了剪切肉所需的力。因此，结果表明冷藏解冻和微波解冻可以增加肉的嫩度。由以上结果可知，微波解冻相比于冷藏解冻，肉样具有更好的保水性、色泽和嫩度，其中微波-2解冻肉样的品质与鲜肉更为接近。

2.3 不同解冻方式对水溶性蛋白含量及盐溶性蛋白含量的影响

图2 不同解冻方式对肉样水溶性蛋白含量（A）及盐溶性蛋白含量（B）的影响Fig. 2 Effect of different thawing methods on water-soluble (A) and salt-soluble (B) protein contents of meat samples

由图2A、B可知，3 种解冻肉样的水溶性蛋白含量与盐溶性蛋白含量差异显著（P＜0.05，P＜0.01），并且解冻肉样与鲜肉相比，水溶性蛋白含量和盐溶性蛋白含量均极显著降低（P＜0.01）。微波-1与微波-2解冻肉样的水溶性蛋白含量（分别为22.60 mg/g和21.73 mg/g）差异显著（P＜0.05），并且均极显著高于冷藏解冻肉样（P＜0.01），冷藏解冻肉样的水溶性蛋白含量最低（17.59 mg/g）。这是由于冷藏解冻过程中冰晶对细胞壁破坏严重，解冻损失大，导致水溶性蛋白的流失最为严重，而微波所具有的穿透性破坏了部分冰晶结构，进而保全了细胞的完整性，降低了水溶性蛋白的损失。微波解冻肉样的盐溶性蛋白含量均极显著高于冷藏解冻肉样（P＜0.01）。微波-1解冻肉样的盐溶性蛋白含量（31.76 mg/g）与鲜肉最为接近。

水溶性蛋白含量和盐溶性蛋白含量的结果显示，微波解冻造成的水溶性蛋白和盐溶性蛋白的损失量比冷藏解冻小，这可能是微波解冻肉样相比于冷藏解冻肉样具有更好颜色与嫩度的原因之一。

表2 猪肉食用品质特性指标相关性分析Table 2 Correlation analysis of pork quality characteristics

表2结果显示，解冻损失率与a*值和蒸煮损失率具有显著相关性（P＜0.05），相关系数（r）分别为0.721和0.702；蒸煮损失率与盐溶性蛋白含量呈显著负相关（P＜0.05，r＝-0.675）；水溶性蛋白含量、盐溶性蛋白含量与L*、a*和b*值都具有极显著的正相关性（P＜0.01），表明解冻损失与蒸煮损失是肉色泽的决定因素。水溶性蛋白含量对肉剪切力具有显著影响，呈极显著正相关（P＜0.01，r＝0.789），这一结果表明肉中水溶性蛋白含量越高肉嫩度越差。同时，b*值与剪切力呈极显著正相关（P＜0.01，r＝0.756），而从表1的结果中并未发现这一特性，其显示冷藏解冻肉样的b*值最低但其剪切力并不低，因此b*值与剪切力之间仍存在着较为复杂的关联，仍需进一步深入研究。

2.4 解冻猪肉的LF-NMR T2分析及其相关性分析

LF-NMR用于肉与肉制品水分研究主要采用横向弛豫时间（T2）来表示水分[27-28]。Bertram等[29]在对NMRT2弛豫研究中确定肉类中存在3 种不同水分，即T2B（1～10 ms）、T21（30～60 ms）和T22（100～400 ms）。马莹等[30]对牛肉贮藏水分含量变化的研究中得到4 个组分，认为其分别代表强结合水、弱结合水、可移动水及自由水，分别表示为T20（0～1 ms）、T21（1～10 ms）、T22（10～100 ms）和T23（100～1 000 ms）。不同T2区间的积分面积占总积分面积的百分比可以表示各个区间氢质子的相对含量[31]。

图3 肉样横向弛豫时间T2变化的三维瀑布图Fig. 3 A three-dimensional waterfall plot for T2 changes of meat samples

根据图3可知，拟合后肉样的NMRT2谱有3 个峰，分别表示为T21、T22、T23，相应代表结合水、不易流动水和自由水。其中T21、T22、T23分别包含3 个指标（表3），即峰顶点时间、峰面积和峰比例。

表3 不同解冻方式下肉样横向弛豫时间T2的变化Table 3 Changes in transverse relaxation time T2 of meat samples subjected to different thawing methods

由表3可知，解冻方式对T21峰顶点时间无统计学影响，对T21峰面积和峰比例有显著影响。与鲜肉相比，微波-2解冻肉样的T21峰面积（P＜0.01）和峰比例（P＜0.05）显著增加，说明微波-2使肉样中的结合水含量增加；冷藏解冻和微波-1解冻肉样的T21峰面积和峰比例无统计学差异。由此说明冷藏解冻肉样中的结合水含量减少，微波-1解冻肉样中的结合水含量无显著变化，微波-2解冻肉样中的结合水含量增加。

解冻方式对T22峰顶点时间无统计学影响，对T22峰比例和峰面积有显著影响（表3）。与鲜肉相比，仅微波-1解冻肉样的T22峰面积增加；冷藏解冻和微波-2解冻肉样的T22峰面虽无统计学差异，但T22峰面积平均值都呈减少的趋势，T22峰比例都显著降低（P＜0.05）。此外，微波-1解冻肉样的T22峰比例极显著高于微波-2肉样（P＜0.01）。这一结果表明冷藏解冻和微波-2解冻肉样中的不易流动水含量减少，微波-1解冻肉样中的不易流动水无显著变化但有增加的趋势。

解冻方式对T23峰顶点时间、T23峰面积和峰比例均有显著影响（表3）。与鲜肉相比，冷藏解冻肉样的T23峰顶点时间显著缩短（P＜0.05），T23峰面积和峰比例显著增加（P＜0.05）；微波-1解冻肉样的T23峰面积和峰比例极显著减少（P＜0.01），T23峰顶点时间无显著变化；微波-2解冻肉样的T23峰顶点时间、T23峰面积和峰比例均无显著变化，但T23峰面积和峰比例的平均值均高于鲜肉。此外，冷藏解冻和微波-1解冻肉样间的T23峰顶点时间差异极显著（P＜0.01）。表明冷藏解冻肉样中的自由水含量增加，微波-1解冻肉样中的自由水含量降低，微波-2解冻肉样中的自由水含量无变化。

此外，各解冻肉样的T2峰面积总和与鲜肉相比无差异。因此，综上可知，不同的解冻方式对冻猪肉的横向弛豫时间T2的影响也不尽相同。冻猪肉解冻过程中发生了不同水分群之间的水分迁移。本实验结果表明，冷藏解冻使冻猪肉中的不易流动水向自由水进行迁移，微波-1解冻则使冻猪肉中的自由水向不易流动水进行迁移，而微波-2解冻更倾向于将不易流动水向结合水迁移。这一结果进一步解释了冷藏解冻肉样的解冻损失率与蒸煮损失率显著高于微波-2解冻肉样以及WHC显著低于微波-2解冻肉样的原因，进而导致水溶性蛋白含量减少和a*值下降，肉质变差。

2.5 感官评价

表4 不同解冻方式的猪肉感官特性评分Table 4 Sensory quality characteristics of frozen pork subjected to different thawing methods

如表4所示，冷藏解冻肉样的质地、多汁性和整体可接受性评分均极显著低于微波解冻肉样（P＜0.01）。此外，统计分析结果显示两种微波解冻肉样的各项感官评分与鲜肉无显著性差异，但微波-2解冻肉样各感官评分跟接近与鲜肉，其中质地的评分还要高于鲜肉。Lee等[32]的研究表明冷冻猪肉在不同温度下解冻，其质地和多汁性存在差异，本实验结果显示冷冻猪肉在不同的解冻方式下其质地、多汁性及整体可接受性均有差异。

3 结 论

本研究表明，微波解冻速度快，可极显著降低解冻损失且可有效提高肉嫩度（P＜0.01），其中微波-2解冻具有最低的解冻损失率、最高的持水能力以及最佳的肉嫩度。相比于鲜肉，3 种解冻肉样的L*、a*、b*值以及水溶性蛋白含量与盐溶性蛋白含量均极显著降低（P＜0.01），但微波解冻肉的这些指标与鲜肉更加接近。LF-NMRT2弛豫的水分分布情况显示，解冻方式对冻猪肉中不同水分群间的迁移具有显著影响，冷藏解冻使冻猪肉中的不易流动水向自由水进行迁移，微波-1解冻则使冻猪肉中的自由水向不易流动水进行迁移，而微波-2解冻更倾向于使不易流动水向结合水迁移，这一定程度上解释了3 种解冻肉样的解冻损失率、蒸煮损失率、WHC、a*值以及水溶性蛋白含量的差异性，说明解冻过程中的水分迁移情况对猪肉的食用品质有一定的影响。感官评价结果显示微波-2解冻肉样各项评估指标评分与鲜肉更接近。因此，微波解冻相比于冷藏解冻能够有效抑制解冻过程中肉质的恶化，综合实验指标分析，在3 种解冻方式中微波-2解冻可以更好地保持猪肉的食用品质。