实验动物屏障设施常用的6种消毒剂

潘明明, 陈枉枉, 王 艳, 王 婧, 周正宇

(苏州大学实验动物中心, 苏州215123)

实验动物屏障设施对病原微生物都有严格的控制要求, 屏障环境中一旦侵入致病性微生物, 在适宜条件下病原微生物的快速增殖可能造成实验动物的感染、发病甚至死亡。病原微生物还会对动物实验结果产生干扰，甚至导致实验失败。实验动物感染人兽共患病还会威胁到人员的健康，因此屏障设施的日常卫生消毒显得尤为重要。

消毒剂按其杀菌效果及杀菌范围可分为低效、中效和高效消毒剂。其中低效消毒剂对多数细菌的繁殖体、部分病毒、以及部分真菌等有消毒效果；中效消毒剂可以杀灭更多种类的病原微生物，但对细菌芽孢作用较差；高效消毒剂除中效消毒剂的杀菌范围外，对细菌的芽孢、亲水类病毒等也具有较好的杀灭效果[1]。本文选取了屏障设施常用的6种消毒剂：过氧乙酸、过氧化氢、百毒杀、新洁尔灭、微酸性电解水、过硫酸氢钾复合盐，对其性质、作用机理、毒性、职业健康安全、应用效果等方面进行综述。

1 过氧乙酸

过氧乙酸是一种强氧化剂，属于高效消毒剂，具有刺激性气味，易挥发，性质不稳定，需现用现配，高浓度溶液(＞45%)剧烈碰撞或加热可发生爆炸，因此需贮存在阴凉通风处。过氧乙酸具有较强腐蚀性，有漂白作用，对铝腐蚀性较弱，对铜和碳钢腐蚀性较强，但对不锈钢基本无腐蚀，适用于耐腐蚀、短时间内需达到杀菌效果的设施设备等[2-5]。其作用机理为强氧化作用，遇有机物释放出新生态氧而起氧化作用。过氧乙酸消毒剂毒性较低，张敏等[6]对16%过氧乙酸毒性研究结果表明，该消毒液对小鼠急性经口LD50为1 882 mg/kg，属于低毒级；急性吸入毒性为实际无毒级；蓄积毒性为弱蓄积毒性；0.5%过氧乙酸对家兔眼睛作用4 s后用生理盐水冲洗，连续观察7 d，结果显示该浓度过氧乙酸对家兔眼睛具有中度刺激性；使用0.5%过氧乙酸对家兔皮肤敷药4 h后除去敷料和残留药物，连续观察48 h，结果显示该浓度过氧乙酸对家兔皮肤具有中度刺激性；同一实验条件下，0.2%过氧乙酸消毒剂对家兔眼睛具有轻度刺激性，对皮肤无刺激性；微核试验显示此消毒剂无致微核作用。宋瑞霞等[7]报道了3.7%过氧乙酸消毒液的毒性研究，结果显示该消毒液属于低毒级，有弱蓄积毒性，对皮肤有轻度刺激，无致畸致突变作用。上述研究说明，常用浓度的过氧乙酸在实验动物屏障设施应用安全性较高。因较高浓度的过氧乙酸对人和实验动物具有一定的刺激性，故在日常屏障设施空气喷雾消毒时，人员需要做好防护，佩戴护目镜，带防毒面具。

过氧乙酸在较低浓度、较短时间内即可达到良好消毒效果，可用于擦拭、浸泡和喷雾消毒。有研究[8-10]报道，0.3%～0.5%过氧乙酸5 min内即可对大多数测试菌如沙门氏菌、布鲁氏菌、假单胞菌、金黄色葡萄球菌等起到良好杀灭效果，0.25%过氧乙酸1 min内即可对白色念珠菌达到良好杀灭效果。余思义[11]使用过氧乙酸消毒液对实验动物饲养器具进行浸泡消毒，结果显示，0.4%过氧乙酸作用10 min、0.2%过氧乙酸作用20 min,均可达到99.9%的杀菌率；使用0.125%过氧乙酸对屏障设施墙面、笼架进行擦拭消毒，可维持99.9%的杀菌率5 d, 且浓度越高, 杀菌效果越好。刘建高等[12]使用0.2%过氧乙酸按8 mL/m3的用量对现场空气喷雾消毒，作用30 min，杀菌率可达95.52%～99.36%。尹进等[13]报道了二元包装的过氧乙酸消毒液(含过氧乙酸、过氧化氢)的杀菌效果，结果显示0.1%的该消毒液按照10 mL/m3的用量对现场喷雾消毒，作用30 min，其对空气自然菌杀菌率达90%以上；悬液定量杀菌结果显示0.01%的该消毒液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌作用5 min，杀菌对数值均大于5； 使用0.1%的该消毒液对枯草芽孢杆菌作用30 min，杀菌对数大于5。郑吟秋等[14]芽孢悬液浸泡试验结果显示，0.2%过氧乙酸对枯草杆菌黑色变种芽孢作用10min，可完全将其杀灭。

综上，在实验动物屏障设施中，建议0.1%～0.5%过氧乙酸用于耐腐蚀的物品、设施设备表面喷雾、擦拭或浸泡消毒；0.2%～0.5%过氧乙酸按8～12 mL/m3的用量用于屏障设施的空气喷雾消毒，每周3～5次。

2 过氧化氢

过氧化氢属于过氧化物类消毒剂，是一种高效消毒剂，具有广谱、高效等优点。过氧化氢汽化后极易被还原成水和氧气，与其他消毒液相比具有无残留的优点。其缺点是性质不稳定，需要现用现配，在屏障设施内使用时需使用配套的设备如过氧化氢蒸汽发生器、过氧化氢等离子体低温灭菌器等设备，成本较高。过氧化氢属于强氧化剂，具有腐蚀性，人员在配制和使用时需要做好防护，避免接触皮肤、黏膜，避免吸入。按照 GBZ 2.1《工作场所有害因素职业接触限值化学有害因素》的标准要求，过氧化氢在环境中的浓度应≤1.5 mg /m3。其杀菌机理主要是消毒液自由基等通过破坏细胞膜而引起膜通透性的改变，以及破坏病原微生物的蛋白质、氨基酸、酶和DNA达到杀灭效果[15]。

汽化的过氧化氢和液体相比，杀菌速率提高，且腐蚀性显著降低。近些年来，随着过氧化氢发生器、过氧化氢等离子低温消毒技术的不断成熟，其应用越来越多。杨文等[16]报道使用过氧化氢发生器对实验动物屏障设施的消毒效果，使用30%过氧化氢溶液按12 mL/m3的用量对饲养室进行汽化处理，作用60 min，对饲养室空气、墙面及工作台面杀菌率可达100%。郑吟秋等[14]报道2%过氧化氢作用10 min，即可对枯草杆菌黑色变种芽孢悬液达到良好杀灭效果。蔡标等[17]使用汽化过氧化氢发生器将30%过氧化氢，按3.5 mL/m3、7 mL/m3、10.5 mL/m3的用量对微生物实验室进行消毒，结果显示，3.5 mL/m3的用量消毒60 min，对空气杀菌率平均大于90%；7 mL/m3、10.5 mL/m3的用量消毒30 min，对空气杀菌率可达100%；三种用量消毒30 min，均可对工作台面、墙面达到良好的消毒效果。Kaspari等[18]研究了过氧化氢发生器对生物安全三级实验室的消毒效果，以蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌为测试菌，共计在房间的不同位置放置了102个菌片，培养结果显示，其中98个菌片没有菌生长，仅有 4 个菌片在富集培养数日后出现菌落。以上结果均证明汽化的过氧化氢具有良好的消毒效果。

过氧化氢等离子低温消毒技术对于不耐热、不耐湿物品的消毒发挥了重要作用。其原理是过氧化氢等离子体设备将过氧化氢“激发”成高活性的过氧化氢等离子体，该等离子体化学活性强、自由基和紫外线丰富、能量密度高，能破坏微生物细胞壁、DNA等遗传物质，从而杀灭微生物[19]。该技术的优点是杀菌效果好、作用时间短、无残留、安全、穿透力强等，常用于表面消毒，现多用于医疗器械、物品的消毒。其缺点是操作不当会引起灭菌失败，对灭菌物品有一定要求，如清洁程度、干燥程度、材质、结构等[20]。此外，过氧化氢与一些理化因子具有协同增效作用，展现出了良好的应用前景，如紫外线、银离子、过氧乙酸等。李朋朋等[21]的研究结果显示，400倍稀释的过氧化氢银离子复方消毒液(含过氧化氢0.075%，银离子1 mg/L)对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、多杀性巴氏杆菌等作用5 min，杀菌率均达到97.8%以上；25倍稀释的过氧化氢复合消毒液对蜡样芽孢杆菌作用30 min，可将其完全杀灭。

综上，30%过氧化氢按照3.5～12 mL/m3的用量经发生器雾化后，消毒60 min，可用于新启用的实验动物屏障设施或屏障设施被污染后的消毒；过氧化氢等离子低温消毒可用于不耐热、不耐湿的仪器设备、实验物品的消毒；复合型过氧化氢消毒液可用于屏障设施空气的日常消毒，物品表面喷洒、擦拭消毒等。

3 新洁尔灭

新洁尔灭即苯扎溴铵，属于季铵盐类消毒剂，是一种阳离子表面活性剂。新洁尔灭刺激性、腐蚀性小，性质稳定，耐光耐热，无挥发性，可较长时间贮存，忌与银离子表面活性剂、碘化物、过氧化物、肥皂、碱性类消毒液合用。水体pH对新洁尔灭影响较大，在碱性环境中效果好，并且pH越高，杀菌效果越好，与乙醇合用可以增强消毒效果[22]。新洁尔灭对革兰氏阳性菌及真菌效果较好，对革兰氏阴性杆菌及肠道病毒作用弱，对结核杆菌及芽孢无效[23]，属于低效消毒剂。其作用机理是通过改变菌体菌膜的通透性, 使菌体破裂, 蛋白变性, 从而起杀菌效果[24]。常用浓度的新洁尔灭消毒液毒性较低，其对小鼠的急性经口毒性LD50＞5 000 mg/kg，属于实际无毒级，对骨髓细胞无致微核作用[25]。

新洁尔灭可以使用浸泡消毒、擦拭消毒和喷雾消毒方法[22,26]，杀菌效果较好。陈峰[27]研究结果显示，0.05%新洁尔灭对小鼠饲养笼盒和水瓶浸泡消毒10 min，杀菌率达到98.6%以上，消毒40 min，杀菌率可达100%；0.1%新洁尔灭对小鼠笼盒和水瓶浸泡消毒10 min，杀菌率达到99.6%，消毒30 min，杀菌率可达100%； 0.05%新洁尔灭按30 mL/m3的用量对屏障设施内空气和墙体喷雾消毒, 杀菌率在消毒后第1日可达100%,第2日可维持在90%以上，效果优于0.1%、0.01%新洁尔灭，原因可能是较高浓度的新洁尔灭产生了较多泡沫，影响喷雾效果；0.1%新洁尔灭用于墙体和笼架擦拭，前2日杀菌率达100%，可维持98%以上的杀菌率3 d，效果优于0.05%、0.01%的新洁尔灭。宗阿南等[28]使用0.1%新洁尔灭溶液对动物实验室墙面、地面进行擦拭消毒，消毒前先用清水擦拭，可取得满意的消毒效果。曲建全等[29]采用定量悬浮试验验证了0.2%新洁尔灭溶液杀菌效果, 结果表明0.2%新洁尔灭溶液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念球菌作用30 min，杀菌率均可达到99.9%以上。

综上，建议0.05%～0.2%的新洁尔灭用于实验动物屏障设施墙体和笼架擦拭，每周1～2次；0.05%～0.1%的新洁尔灭用于实验动物屏障设施内空气喷雾消毒，每周3～5次；0.1%～0.2%的新洁尔灭用于物品表面擦拭、浸泡消毒。

4 百毒杀

百毒杀通用名为癸甲溴铵溶液，双链季铵盐类，稳定性较好，受pH影响小，在碱性环境下消毒效果增强。其腐蚀性、刺激性小，受有机物和水质影响小，对硬水有一定抵抗力。百毒杀作用机理与新洁尔灭相同，通过改变菌体菌膜的通透性，使菌体破裂，蛋白质变性，从而起杀菌效果。百毒杀消毒效果优于苯扎溴铵，低浓度具有抑菌作用，高浓度可杀菌，对常见细菌、真菌、亲脂性病毒效果好，但对芽孢、无囊膜的病毒作用差，属于中效消毒剂。百毒杀有一定的黏膜刺激性，因此使用时人员需注意做好防护，防止溅入眼睛。百毒杀毒性较低, 据相关报道[30],雌性小鼠口服百毒杀LD50为681 mg/kg，雄性小鼠口服百毒杀的LD50为316 mg/kg，属于中等毒性级别。王戈等[31]研究结果显示，百毒杀对小鼠骨髓细胞微核作用为阴性。

百毒杀实际应用效果较好，邝少松等[32]报道了使用1∶600的百毒杀每日对屏障设施内的笼架、地面、天花板、室内物品擦拭消毒，每周2次按照10 mL/m3的用量对室内空气进行喷雾消毒, 消毒30min, 物品表面杀菌率可达80%～100%，空气杀菌率可达85%。陈峰[27]使用1∶600稀释的百毒杀，对小鼠笼盒和水瓶浸泡消毒20 min，杀菌率可达到99%；1∶200稀释对小鼠笼盒和水瓶浸泡消毒20 min，杀菌率达到100%； 1∶600稀释浓度按30 mL/m3的用量对屏障设施内空气和墙体喷雾消毒，杀菌率在消毒后3 d可维持在97%以上，消毒效果优于1∶200和1∶100的稀释浓度，可能是由于高浓度的百毒杀会产生大量泡沫，影响喷雾效果；1∶600和1∶200稀释用于墙体和笼架擦拭消毒, 可维持100%杀菌率3 d，1∶100稀释则可维持100%杀菌率5 d。马贤坤等[33]的试验结果显示，0.05%百毒杀溶液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌作用1min，杀菌率达到99.5%；0.0334%百毒杀溶液对链球菌、巴氏杆菌、沙门氏菌作用1 min，杀菌率达100%。

综上，建议1∶600～1∶100稀释的百毒杀用于实验动物屏障设施墙体、笼架擦拭消毒，每周1～2次；1∶400～1∶600稀释的百毒杀用于屏障设施空气、工作台面等的喷雾消毒，每周2～3次；1∶600～1∶100稀释的百毒杀用于物品表面擦拭、浸泡消毒。

5 微酸性电解水

微酸性电解水是通过电解盐溶液或稀盐酸溶液得到的pH在5.0～6.5，并具有一定氧化还原电位、有效氯和活性氧的溶液。微酸性电解水的杀菌机制是，其较低pH 值和较高的氧化还原电位破坏了病原微生物的细胞膜电位，改变了膜的通透性，从而影响细菌的正常代谢。此外，电解过程中产生一定量的有效氯、活性氧具有氧化杀菌的作用[34]。

微酸性电解水的毒性较低，应用于动物设施消毒安全性高。关文怡等[35]按63 mg/kg的剂量连续30 d给大鼠灌胃给药，结果显示该剂量的微酸性电解水对大鼠生理生化等指标未见明显影响。使用有效氯浓度为200 mg/L的微酸性电解水每日对兔舍进行喷雾消毒，连续30 d，动物血液生化指标未见明显异常[36]。Inagaki等[37]报道了饮用微酸性电解水对小鼠影响的研究，实验用无菌水作为对照，微酸性电解水有效氯浓度为5 mg/L，连续饮用12周，结果表明，与无菌水组对比实验组小鼠血液生化指标、体质量、病理解剖等均未见明显异常，并且微酸性电解水在使用过程中有明显的抑菌作用，该研究建议使用有效氯浓度为5 mg/L的微酸性电解水替代小鼠无菌水作为小鼠日常饲养饮用水。

目前微酸性电解水已较多应用于食品行业、畜牧养殖环境消毒等，但在实验动物屏障设施中的应用报道较少。姬真真等[38]使用微酸性电解水对肉鸡鸡舍进行喷雾消毒，结果表明有效氯浓度为50 mg/L的微酸性电解水可有效降低环境微粒，对空气菌杀菌率可达50.36%。刘文等[39]使用有效氯浓度为90 mg/L的微酸性电解水对猪舍空气进行喷雾消毒，结果显示该浓度的微酸性电解水可以明显减少猪舍空气中细菌总数和金黄色葡萄球菌的数量, 并且可维持消毒效果至少3 d。南松剑[40]的研究结果显示，有效氯浓度为2 mg/L的微酸性电解水对大肠杆菌作用3 min，杀菌率达到100%；有效氯浓度为8 mg/L的微酸性电解水对金黄色葡萄球菌作用3 min，杀菌率达到100%；腐蚀性试验表明微酸性电解水对304不锈钢基本无腐蚀，对碳钢轻度腐蚀；对奶牛乳头皮肤一次性消毒试验结果显示，有效氯浓度60 mg/L的微酸性电解水效果优于0.5%的聚维酮碘； 饮水消毒试验结果显示，有效氯浓度为1 mg/L的微酸性电解水对奶牛饮水消毒10 min，可完全杀灭其中的细菌；对牛舍空气喷雾消毒试验结果显示，有效氯浓度60 mg/L的微酸性电解水按照60 mL/m3的用量对牛舍空气消毒，杀菌率可达61%，且效果明显优于戊二醛、百毒杀、二氯异氰尿酸钠等常用消毒剂。赫晓霞[41]研究了微酸性电解水对几种病毒的杀灭效果，结果显示, 有效氯浓度≥50 mg/L的微酸性电解水对猪蓝耳和猪伪狂犬病毒处理10 min, 可完全将其灭活； 研究还发现微酸性电解水喷雾使用会影响其杀菌活性。倪莉[42]研究了有效氯浓度100 mg/L的微酸性电解水、312 mg/L的双癸基二甲基溴化铵溶液和166 mg/L的苯扎氯铵溶液3种消毒液对鸡舍墙面、设备物品表面、地面喷雾消毒的效果，结果表明，使用微酸性电解水喷雾消毒效果显著高于其他2种消毒液。

综上，微酸性电解水是一种广谱高效、腐蚀小、毒性小的新型消毒剂，建议使用有效氯浓度为60～100 mg/L的微酸性电解水用于屏障设施、设备表面喷雾、擦拭消毒及空气喷雾消毒。

6 过硫酸氢钾复合盐

过硫酸氢钾复合盐是一种新型的酸式过氧化物类消毒剂，易溶于水，1%过硫酸氢钾复合盐溶液pH在2.4左右，具有广谱、高效、绿色、环保等优点，对各种常见病原体均有良好的杀灭效果。过硫酸氢钾复合盐溶液具有强氧化性，对金属有一定腐蚀性，吉中山等[43]研究结果表明，0.1%过硫酸氢钾复合盐溶液对不锈钢基本无腐蚀，对碳钢、铜等有较强的腐蚀性，其水溶液稳定性较差。但也有报道[44]一种过硫酸氢钾复合盐泡腾片溶解配制成消毒液后，15 d内可保持杀菌能力在99.9%以上，有效氯浓度下降＜6%，稳定性较好。过硫酸氢钾复合盐作用机理是溶解后通过循环链式反应产生大量高活性杀菌物质，如次氯酸、新生态氧、自由基等，通过破坏菌体细胞膜通透性，干扰菌体DNA、RNA合成等而起杀菌作用。应用浓度的过硫酸氢钾复合盐溶液毒性低，刺激性低。0.15%单过硫酸氢钾复合盐溶液对小鼠LD50为4 300 mg/kg，属于低毒级，此浓度对家兔皮肤无刺激性，细胞微核试验显示为无影响[45]。任欢欢等[46]使用0.1%的过硫酸氢钾复合盐消毒液对家兔皮肤作用4 h后用温水清洗干净，连续观察48 h，结果显示对家兔皮肤无刺激性；将0.1%的过硫酸氢钾复合盐0.1 mL滴入家兔眼睛, 闭合数秒, 30 min后用生理盐水冲洗，连续观察48 h，结果显示对家兔眼睛无刺激性。

过硫酸氢钾复合盐溶液杀菌效果好, 已广泛应用于畜牧业、饮水消毒等, 但其在实验动物设施中的应用报道较少。王娟等[47]研究结果显示, 过硫酸氢钾复合盐对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等作用10 min, 杀菌对数值＞5时所需要的浓度分别为230 mg/L、57.5 mg/L、460 mg/L,而作用60 min所需浓度分别为28.75 mg/L、28.75 mg/L、230 mg/L, 并且温度升高可以显著提高过硫酸氢钾复合盐的杀菌效果。任欢欢等[46]报道了一种过硫酸氢钾复合盐泡腾片的相关性能研究, 结果表明0.05%的过硫酸氢钾复合盐消毒液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌作用10 min, 对黑曲霉菌作用20 min, 杀菌对数值＞4； 0.5%的该消毒液对枯草杆菌黑色变种芽孢作用10 min, 可完全将其杀灭； 使用0.1%的过硫酸氢钾复合盐消毒液对万级洁净车间物体表面擦拭消毒，作用10 min，杀菌率可达99.88%。刘娜等[48]研究表明，0.5%过硫酸氢钾复合盐溶液对鸡场地面、墙面、饮水器、食槽作用5 min，即可达到99.9%以上的杀菌率； 0.25%过硫酸氢钾复合盐溶液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌作用5 min即可将其完全杀灭。李世康等[49]研究结果显示，用浓度为10 mg /L的复方单过硫酸氢钾消毒液对人工污染水样中大肠杆菌作用30 min，杀菌率可达100%，且该消毒液稳定性良好，存放90 d有效含量下降7.68%。

综上, 0.1%～0.5%过硫酸氢钾复合盐溶液可用于实验动物屏障设施耐腐蚀物品表面喷雾、擦拭、浸泡消毒； 设施设备表面擦拭、喷雾消毒等。

理想的消毒液应是杀菌谱广，作用迅速，性能比较稳定，无毒、无味、无刺激性，方便使用又不能污染环境，受环境因素影响小，使用浓度低，价格低廉。然而，到目前为止尚无一种消毒剂能够达到这些标准。在实际使用过程中，现有的消毒剂都存在各自的优缺点。

消毒剂联合使用、复方消毒剂、消毒剂新剂型、物理因子与化学消毒剂协同作用、定期更换消毒液种类的方法可在一定程度上弥补单一消毒液自身存在的不足，如新洁尔灭和75%乙醇联用、物品用化学消毒液消毒后在结合紫外灯照射、定期更换屏障设施内消毒液的种类防止耐药菌的产生等。实验动物屏障设施在选择使用消毒剂时，应根据消毒剂不同特点，屏障设施具体情况如饲养密度、布局、污染状况等进行综合判断，同时还要考虑到理化因素对化学消毒剂的影响，如温度、湿度、酸碱度、有机物、化学拮抗或中和作用以及消毒剂浓度的变化等。此外，屏障设施的不同区域，如屏障设施墙面、地面、仪器设备表面、工作台面、不同功能区等，都应按屏障设施的使用、污染情况制定出定期的清洁消毒方案。在实施具体的清洁消毒时，物理性的清洁也是不容忽视的一步，在消毒前先用灭菌水将待消毒区域擦拭干净, 干燥后再使用消毒剂可以达到令人满意的效果。这种做法的好处是一方面减少有机物对消毒液的影响, 另一方面可以去除一部分附着的病原体。各单位应结合自身情况,综合考虑各方面因素制定出一套合理的屏障设施日常维持性消毒方案，具体可包括消毒液种类、用量、用法、定期更换、使用频次、使用区域等。有条件的单位可以进行相应的消毒效果验证研究，制定出更加科学合理的消毒操作规程。