裸鼹鼠与小鼠抗辐射能力比较研究

陈 超, 丛 薇, 杨文静, 崔淑芳

(海军军医大学基础医学院实验动物学教研室, 上海 200433)

1980年代，裸鼹鼠被发现是一种奇特的真社会性哺乳动物，其终生在离地约2 m的地下洞穴生活，几乎完全丧失了视觉，仅依靠身体两侧的触须来辨认方向；虽属哺乳动物，却又类似冷血动物通过与环境的热交换来调节体温。裸鼹鼠拥有长达30年以上的寿命，同时还能在低氧、高二氧化碳浓度的地下环境中生活，对癌症具有超级免疫力[1-3]。电离辐射广泛存在于自然界中，具有波长短、频率高、能量高等特点，如机体暴露于辐照条件下，接受照射超过一定剂量会导致组织中分子和原子之间的化学键被破坏，从而对机体重要的生化结构与功能产生严重影响，造成急慢性辐照损伤、辐照诱变和辐照致癌[4]。世界卫生组织国际癌症研究机构已将电离辐射(所有类型)列入一类致癌物清单。60Co放射源的应用非常广泛，如：辐射育种、食品辐照保藏与保鲜、无损探伤、辐射消毒、肿瘤的放射治疗等。其产生的γ射线能破坏细胞中的DNA和RNA，使受损的DNA和RNA发生降解，失去合成蛋白质和遗传功能，从而对机体造成损伤[5]。为了探讨实验室驯化的裸鼹鼠对电离辐射的耐受性，本课题组利用不同剂量和不同照射频率60Coγ射线分别对裸鼹鼠和小鼠及两者的皮肤成纤维细胞进行辐照，观察两种动物的生存及病理变化，直观、系统地观察到裸鼹鼠抗电离辐射的现象，为进一步研究其抗电离辐射机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞

52周龄雄性裸鼹鼠，由本实验室自行繁殖(第6世代)饲养； 8周龄雄性ICR小鼠、C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司[SCXK(沪)2013-016]。动物均饲养在屏障设施[SYXK(沪)2017-0004]。裸鼹鼠和C57BL/6J小鼠原代皮肤成纤维细胞按照本实验室前期方法分离培养[6]。

1.2 主要仪器及试剂

细胞培养箱购自新加坡Esco公司，流式细胞仪购自美国BD公司，DMEM低糖培养基、胎牛血清、青链霉素、胰酶购自美国Gibco公司；I型胶原酶购自美国Sigma公司；荧光标记流式用抗体购自美国Biolegend公司；小鼠IgG干粉购自索莱宝公司；活性氧(ROS)测定试剂盒购自南京建成生物。60Coγ线全身照射由海军军医大学辐照中心完成。

1.3 实验方法

1.3.1 6 Gy一次性全身辐照对裸鼹鼠的影响60Co γ线6 Gy分别一次性全身照射裸鼹鼠和小鼠，辐照剂量率0.88 Gy/min。辐照后观察动物的大体状态。记录辐照后30 d内动物的死亡情况，计算死亡率。流式细胞术检测动物0 d、2 d、3 d、4 d外周血中的辅助性T淋巴细胞和杀伤性淋巴细胞比值(CD4+/CD8+)； 流式细胞术每周(0～4 周)检测动物外周血中的树突状细胞(dendritic cells, DC)百分比。裸鼹鼠组10只；小鼠组ICR小鼠、C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠各10只，均为雄性。

1.3.2 低剂量多次全身辐照裸鼹鼠的病理观察60Coγ线1.75 Gy分别全身分次照射裸鼹鼠和小鼠，每周照射1次，共4次，累积剂量为7.0 Gy，辐照剂量率0.88 Gy/min。辐照期间观察动物的大体状态。10个月后安死术处死动物, 观察胸腺、脾脏、肝脏、肠系膜淋巴结、骨髓等组织脏器变化情况, 并进行组织切片观察。裸鼹鼠组10只；小鼠组ICR小鼠、C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠各10只，均为雄性。

1.3.3 裸鼹鼠及C57BL/6J小鼠皮肤成纤维细胞辐照后的氧损伤测定 裸鼹鼠与C57BL/6J小鼠皮肤成纤维细胞分别接种6孔细胞培养板, 每种细胞3个复孔, 培养箱培养24 h后进行60Coγ线辐照, 辐照剂量为6 Gy和50 Gy, 辐照剂量率0.88 Gy/min。辐照后正常培养24 h，去除细胞培养液, 加入稀释好的2’, 7’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)覆盖细胞。DCFH-DA稀释方法：以1∶1 000的比例用无血清培养液稀释活性氧(ROS)测定试剂盒中的DCFH-DA，使DCFH-DA终浓度为10 μmol/L。37 ℃体细胞培养箱内孵育30 min，去除DCFH-DA溶液，PBS洗细胞，用0.25%的胰酶消化细胞5 min，加入含血清的培养基中和反应，1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测。

1.3.4 数据统计学处理 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，数据以±s的形式表示，组间差异比较采用ANOVA分析，进一步两组间比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 6 Gy一次性全身辐照对裸鼹鼠的影响

6 Gy60Coγ射线一次性辐照活体动物，辐照后第3日起，小鼠陆续出现饮食和活动减少，毛发蓬松，精神萎靡等状态，而裸鼹鼠生命活动正常。裸鼹鼠30 d存活率能够达到100%, 而小鼠只有30%(图1A)。通过T淋巴细胞亚群检测发现,辐照后2 d的CD4+/CD8+出现明显升高, 在辐照后4 d升高更为显著； 小鼠CD4+/CD8+则无显著变化(图1B)。裸鼹鼠辐照后1 d外周血DC细胞即有明显升高, 辐照后7 d虽略有回降, 却仍保持较本底略高的水平, 而14 d裸鼹鼠外周血DC细胞水平升高近7倍； 小鼠外周血DC细胞水平变化则相对较小(图1C)。所有小鼠组数据均为ICR小鼠、C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠合计统计数据。

2.2 低剂量多次全身辐照裸鼹鼠的病理观察

少量多次辐照后裸鼹鼠和小鼠饮食和精神状态都比较正常。在观察后期(6个月后)，部分小鼠开始消瘦，毛发蓬松，不爱活动； 裸鼹鼠无异常表现。少量多次辐照后小鼠骨组织以骨髓腔内红骨髓(有造血功能)的减少为主要病变；裸鼹鼠的骨组织呈现轻微的纤维化，骨髓腔内的细胞成分无异常。小鼠的胸腺、肝脾有不同程度的肿大，肠黏膜上皮大范围脱落、缺失，肠腔中可见脱落的上皮细胞。裸鼹鼠肠黏膜各级结构完整，肠上皮细胞数量丰富、排列整齐，未见明显异常。其中裸鼹鼠的胸腺存在比较明显的退化，故病理图中无裸鼹鼠胸腺染色图(图2)。

图2 少量多次辐照后动物组织病理学观察(HE×400)

图1 60Coγ射线一次性6 Gy全身辐照对裸鼹鼠的影响

2.3 辐照后裸鼹鼠皮肤成纤维细胞的氧损伤测定

裸鼹鼠和C57BL/6J小鼠的皮肤成纤维细胞在6 Gy剂量辐照24 h后细胞ROS含量无显著变化。而50 Gy剂量辐照24 h后，皮肤成纤维细胞的ROS含量显著增加，裸鼹鼠皮肤成纤维细胞升高了近5倍，C57BL/6J小鼠皮肤成纤维细胞则升高了将近50倍(表1)。

表1 辐照后24 h裸鼹鼠和C57BL/6J小鼠皮肤成纤维细胞ROS含量

3 讨论

最新研究[7]表明，裸鼹鼠较小鼠有更强的免疫反馈能力，其去除大块病变的效率是小鼠的2～3倍，去除尿嘧啶的效率是1.5～3倍，切割AP位点的效率比小鼠细胞高约1.4倍。CD4+T淋巴细胞可以激活CD8+T淋巴细胞，确保建立并维持细胞毒性作用[8]。CD8+T淋巴细胞可以抑制抗体合成及T淋巴细胞增殖过程，两者之间存在平衡关系，也是维持体液免疫与细胞免疫重要的调节者，对于保持内环境稳态具有重要作用[9]。两者比值升高提示机体细胞免疫处在活跃状态，而比值降低则提示机体处于免疫抑制状态[10]。本研究结果表明，裸鼹鼠在6Gy剂量一次性辐照后，CD4+/CD8+比值显著升高，而小鼠无明显变化，表明裸鼹鼠具有比小鼠更高效的免疫反馈系统，与以往研究结果一致，这可能是裸鼹鼠抗辐射特性产生的重要原因。

DC是目前已知的最有效的抗原呈递细胞和唯一具有激活静息性T淋巴能力的抗原递呈细胞，而其强大的抗原呈递功能在机体的免疫应答(特别是初次免疫应答)中扮演着重要的角色[11]。本研究结果表明，辐照后裸鼹鼠DC水平明显升高，而小鼠无明显变化，这表明裸鼹鼠拥有比小鼠更高的免疫应答水平，这可能也是裸鼹鼠抗辐射特性产生的重要原因。

辐射会诱导细胞产生ROS，ROS会攻击生物膜上磷脂中的多不饱和脂肪酸，引发膜脂质过氧化链式反应，破坏细胞膜结构[12,13]。正常皮肤成纤维细胞中有比较完善的氧化与抗氧化系统，如：超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、抗坏血酸、维生素E等，它们可以快速清除细胞内的ROS，保持细胞与组织的稳定与平衡[14]。本研究分离所得裸鼹鼠和C57BL/6J小鼠皮肤成纤维细胞在6 Gy剂量辐照下ROS无显著变化，说明两者具有正常皮肤成纤维细胞的抗氧化系统；在50 Gy剂量辐照下，C57BL/6J小鼠皮肤成纤维细胞ROS升高倍数比裸鼹鼠皮肤成纤维细胞ROS升高倍数更显著，这说明裸鼹鼠皮肤成纤维细胞受到的氧损伤比C57BL/6J小鼠皮肤成纤维细胞低得多，证明裸鼹鼠皮肤成纤维细胞同样具有卓越的抗辐射特性。

综上所述，裸鼹鼠在活体水平拥有卓越的抗辐射特性，这可能是由于其拥有良好的免疫应答和免疫反馈系统。裸鼹鼠皮肤成纤维细胞拥有比小鼠皮肤成纤维细胞更良好的抗辐射特性。本文研究结果为进一步研究裸鼹鼠抗电离辐射机制提供了理论基础和实验依据。