Phoenix-100全自动微生物分析系统对碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌鉴定及预警能力的评价

卢燕芳 ，李彬 ，林齐立 ，陈玮媛 ，张婧玲

(1.福建省妇幼保健院检验科，福建 福州 350001；2.福建医科大学附属协和医院检验科，福建 福州 350001；3.福建医科大学医学与技术工程学院，福建 福州350001)

Phoenix-100全自动微生物分析系统是临床常用的全自动微生物鉴定与药敏仪之一，可以快速高效地对多种微生物进行鉴定与药敏分析，其高级专家系统（AES）更能提示菌株可能存在的耐药机制，对临床诊疗有重要的指导意义[1]。近年来，CRE菌株的出现给临床抗感染治疗带来了极大的挑战[2]，临床微生物实验室应评价其所用的全自动微生物鉴定与药敏仪对CRE的鉴定及预警功能，以降低漏检率，防止耐药菌株的流行[3]。本研究拟探讨Phoenix-100全自动微生物分析系统在CRE鉴定及预警产碳青霉烯酶的可靠性和临床价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 收集2011年8月3日至2012年8月3日某医院临床送检样本中分离并保存的93株非重复的碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌作为受试菌株。

1.1.2 仪器与试剂 Phoenix-100全自动微生物分析系统及相配套的细菌生化NMIC/ID4药敏鉴定卡（购自美国BD公司）。

1.1.3 质控菌株 产酸克雷伯菌ATCC700324、大肠埃希菌ATCC25922。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定与药敏 将初筛的菌落移种至血平板上培养过夜，获得单个纯种菌落；将所获菌株制成相应麦氏浊度的菌液在Phoenix-100全自动微生物分析系统进行鉴定药敏分析，同时对仪器高级专家系统所提示的产酶信息进行统计分析。具体操作步骤参考仪器厂家提供的标准步骤。

1.2.2 耐药基因的检测 煮沸法提取细菌模板DNA，采用PCR特异性的引物序列[4]扩增常见的碳青霉烯耐药基因 （如 blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaNDM），测序PCR阳性产物以确定基因型。

1.2.3 Phoenix-100仪器AES性能指标统计 以PCR法扩增碳青霉烯酶基因后的检测结果为金标准，使用Phoenix-100全自动微生物分析系统对该基因型的碳青霉烯酶菌株数进行鉴定并对AES提示产酶情况的相关性能指标进行统计分析。

2 结果

2.1 CRE菌株分布和Phoenix-100鉴定情况 共筛选出碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌93株，其分布及Phoenix-100全自动微生物分析系统鉴定情况见表1。Phoenix-100全自动微生物分析系统鉴定CRE菌株的符合率为41.9%(39/93)，其中产酸克雷伯菌的符合率最高，为75.0%(3/4)。

表1 CRE菌株的分布和不同菌株中Phoenix-100鉴定情况

2.2 PCR和Phoenix-100 AES系统提示碳青霉烯酶阳性菌株情况 93株CRE中有55株携带碳青霉烯酶耐药基因，而Phoenix-100 AES系统提示44株CRE产碳青霉烯酶，见表2。

2.3 PCR扩增碳青霉烯酶基因及测序结果 通过PCR扩增和测序分析，实验菌株检测出的碳青霉烯酶基因型分布见表3。在携带不同碳青霉烯酶基因型的55株CPE菌株中，Phoenix-100全自动微生物分析系统判定为CRE菌株的能力及AES提示产酶情况有所不同，见表4。

2.4 Phoenix-100 AES检测碳青霉烯酶的参数指标 以PCR扩增碳青霉烯酶基因及DNA测序结果为金标准，Phoenix-100全自动微生物分析系统检测CRE菌株时，AES在提示产碳青霉烯酶方面灵敏度为52.7%，特异性为60.5%，阳性预测值为65.9%，阴性预测值为46.9%，准确度为55.9%。参数指标见表5。

表2 CRE菌株中PCR证实CPE和Phoenix-100提示碳青霉烯酶阳性菌株情况对比

3 讨论

碳青霉烯类抗生素目前被认为是治疗革兰阴性菌感染的最后一道防线，而近年来，碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌所致感染爆发的报道呈现上升趋势，给临床抗感染治疗带来了严峻的挑战[2]。为了解Phoenix-100鉴定CRE菌株的预警能力，本研究收集非重复临床分离的CRE，以PCR结果为金标准，评价Phoenix-100全自动微生物分析系统在鉴定及预测CRE是否产碳青霉烯酶的可靠性，探讨Phoenix-100全自动微生物分析系统检测CRE的性能及预警中的指导价值和临床意义。

表3 碳青霉烯酶基因型病原菌构成比（%）

表4 Phoenix-100对不同碳青霉烯酶基因型菌株的判定和提示产酶情况

表5 Phoenix-100 AES检测肠杆菌科细菌碳青霉烯酶的参数指标

本研究收集的93株CRE菌株主要以肺炎克雷伯菌为主，与目前CRE菌株的研究分布相符[4，5]。本研究发现大量的IMP型碳青霉烯酶基因已在多种肠杆菌科细菌中播散，应引起高度重视。本研究中Phoenix-100对不同菌种CRE预测能力均较低，这与李春娟等[6]的实验结果有较大出入，这可能与不同地域中CRE菌株对亚胺培南或美罗培南的耐药率不同有关。

以PCR为金标准，Phoenix-100 AES筛检碳青霉烯酶阳性的符合率也较低，可能由于一部分产诱导酶的细菌及延迟表达耐药性的细菌在短时间内难达到可检测水平而造成Phoenix-100仪器漏报耐药结果，且仪器对菌悬液的浓度要求相当严格，稍微误差则有可能会不报结果。然而在预测大肠埃希菌是否为碳青霉烯酶阳性时，Phoenix-100 AES系统的阳性提示率反而高于PCR对碳青霉烯酶的检出率（见表2），可能与Phoenix-100仅是表型监测，而一些如生长温度、PH值等非基因因素导致的假阳性影响检出率有关，又或许与PCR未能检出少见碳青霉烯酶基因 （如blaIMI，blaVIM等）有关。

本实验显示Phoenix-100对不同基因型的CRE菌株的预测率不同（见表4），对blaKPC-2与blaNDM-1基因型的CRE预测率远远高于blaIMP-4及blaIMP-8基因型。可能与本研究收集的菌株中blaKPC-2与blaNDM-1基因型的CRE的菌株数量较少有关，必要的时候可以增加CRE菌株的数量与菌属总类进一步确认Phoenix-100全自动微生物分析系统判定CRE的性能。此外，在判定携带blaIMP-4的CRE菌株时，Phoenix-100 AES的阳性提示率高于仪器对CRE的直接鉴定（见表4）。导致该现象的可能原因与菌株复杂的耐药表型而造成Phoenix-100 AES的误判有关。因此，Phoenix-100全自动微生物分析系统可结合如PCR的方法以提高对产酶株检测的准确率。

本结果显示Phoenix-100全自动微生物分析系统对碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌的鉴定及预警能力不足，可能是由于本仪器仅有美罗培南和亚胺培南两种药敏卡片，而并没有厄他培南卡片。但是CLSI推荐[7]使用厄他培南纸片是检测CRE最好的药敏纸片，本仪器缺少的厄他培南药敏信息可能是其鉴定CRE的指导价值低的原因。

综上所述，Phoenix-100全自动微生物分析系统预测CRE菌株的灵敏度较低，对于工作中使用本仪器的临床微生物实验室笔者建议必要时应辅以联用厄他培南纸片扩散法，以提高CRE的检出率，以便临床根据病原菌的种类以及药敏试验结果及时制定有效且合理的治疗方案，来减少产碳青霉烯酶菌株的出现和流行。