江西地区RhD阴性个体的RHD基因与RhCcEe抗原的表达分析

苗燕平，周小英，熊莉，何华庆，李国良，孙瑜

(江西省血液中心，江西 南昌 330052)

Rh血型系统几乎是除了ABO血型系统外最重要的血型系统，是人类最复杂和最具多态性的红细胞血型系统[1]，由位于1号染色体短臂上两个紧密连锁的RHD和RHCE基因编码，两者之间的同源性大于96%，极易发生重组交换和不等交换，产生众多的RHD和RHCE基因变异体，从而影响Rh系统抗原的表达。Rh系统各抗原均有重要的临床意义，如胎母免疫、临床输血等，本研究试图从RhCcEe抗原表达的角度探讨江西地区RhD阴性人群的分子背景，确认本地区相关血型系统的特点，为临床医疗提供一定的参考，现报告如下：

1 材料与方法

1.1 样本来源 江西省血液中心RhD初筛阴性的无偿献血者464名，均为无关人群，年龄18~54周岁，均经研究对象知情同意后采集标本备用。

1.2 主要试剂 血清学试剂中，单克隆抗-C、抗-E、抗-c、抗-e、抗体筛查试剂、抗人球蛋白试剂均来自上海血液生物医药有限责任公司，抗-D抗体分别来自北京金豪、上海血液生物和德国BIOSCOT；基因学试剂有基因组DNA提取试剂盒 （TBG公司）、Taq酶（Promega公司）、RHD 基因分型试剂盒（PCR-SSP法）（天津秀鹏公司）。所有试剂均按说明书在有效期内使用。

1.3 Rh血型系统抗原检测 血清学直接凝集法检测 D、C、c、E、e 抗原，间接抗人球蛋白试验（IAT）确认RhD阴性血型[2]。

1.4 RHD基因分型 对IAT确认为RhD抗原阴性的样本，随机抽取111例，使用PCR-SSP法行RHD基因分型。

1.5 统计学分析 使用直接计数法计算各血型；使用SPSS 19.0对所得数据行统计分析，检验水准设为0.05。

2 结果

2.1 RhD血清学结果 464例标本中，确认为RhD阴性者 451例 (97.1983%)，RhD变异性 13例（2.8017%）。

2.2 RHD基因型与RhCcEe抗原的关系 排除D变异型后，随机抽取111名RhD确认阴性者，使用PCR-SSP方法检测其RHD基因，表型的分布见表1和表2。

3 讨论

Rh血型抗原由2个具有共显性的连锁基因RHD和RHCE基因编码，在染色体上紧密连锁，而且碱基序列非常类似，各含10个外显子，同源性大于96%，这2个血型基因是产生不同Rh表型的遗传基础，而表型是临床免疫反应的基础。随着RhD抗原临床免疫预防的进一步规范，反衬出RhCcEe抗原在临床输血和胎母免疫中的问题越来越突出，RhCcEe抗体引起的新生儿溶血病(HDN)逐年增加，而受血者血清中的同种抗体70%～80%与 RhCcEe抗体有关[3]。2008 年，兰炯采[4]等便发现RhD阴性而存在RHD基因的个体，其表型均为RhC阳性，即CC或Cc，推测或在RhD阴性个体中，RHD基因和RhC表型间存在某种联系，2014年，陈青[5]等人发现在江苏地区人群中，RhD阴性而存在RHD基因的个体中，RHCE*C基因的0.4811，本研究由此得到启示，试图发现本地区RhD阴性人群RhCcEe表型及其与RHD基因间的关系，从此角度探讨RhD的分子背景。

由于目前“红细胞膜D抗原有无”的检测技术标准是经典IAT技术，本研究使用3种抗D试剂以间接抗人球蛋白实验（IAT）检测RhD抗原以确认RhD阴性[6]，但事实上，以往有研究报道，使用血清学方法确定的RhD阴性人群中，有20%～30%为放散型[7，8]，本研究未行吸收放散实验，选择的标本理论上包括了Del型，但是，2010年国内1个由10家血液中心组成的“Del母同种免疫观察”小组[9]，初步观察数百例真实RhD阴性和Del孕妇妊娠RhD阳性胎儿是否发生抗-D同种免疫反应时发现，无1例Del孕妇发生抗-D同种免疫反应，即使其生育＞4次；他们还同时回顾性研究了200多名抗-D阳性的孕妇，结果无1例检测为Del型，且目前，有关Del型致敏的文献并不多见，考虑到Del型临床意义不大，再加上目前Del型的检测所使用的吸收放散实验与操作者水平密切相关，结果的稳定性和重复性并不尽如人意，所以，本研究选择的标本未剔除Del型。

表1 RhD阴性人群RHD基因型与RhCcEe表型的分布关系（n=111）

表2 RHD外显子与RhCcEe抗原表达的关系（n=111）

本研究发现，在111名检测了RHD基因的人群中，九种理论上的RhCcEe表型只检出了五种，其中最多的是ccee(54.96%)，其次是Ccee（32.43%），紧随其后的是CCee（7.21%）和CcEe（2.70%）与 ccEe（2.70%），虽然在人群所占比例上与其他实验室有出入[10，11]，甚至与本室其他时间内不同实验所得结果也有出入[12-14]，但ccee和Ccee占据顺序前两位是一致的，我们认为，这表明各表型在人群中所占比例的结果虽然与地区差异和标本量大小导致的稳定性有关，但是该影响因素在比例较大的表型中的影响不足以改变其在整体中的排列顺序，所以不论在哪个调查中，ccee和Ccee均是主要表型。假如对我们几次的调查做一个统一的研究，或者会更接近于群体的真像，这部分工作将留待进一步的研究后确认。但是作为遗传标志物，血型具有地域特征，本次调查的Rh系统血型对研究江西地区RhD阴性人群遗传学特征来说有一定的意义。

PCR-SSP试剂盒仅仅在111名RhD阴性的献血者中检出了6种RHD等位基因，根据外显子是否完整将其分为三大类，在Fisher精确概率法的提示下，外显子完整性不同的RHD阴性献血者，其RhCcEe表型是有差异的，我们初步判断虽然有地区差异，但RHD基因外显子的差异可能决定了CcEe抗原表达的差异，但是，从本次调查的RHD（-）基因者仅占被调查的RhD阴性人群的4.50%（5/111）来看，调查是有抽样误差的，我们尚须加大样本量，获得更多标本，方能接近更具群体特征的数据。国际上经RHD全基因序列分析鉴定和Genebank登录的部分D中显示的D类别（D category）中，本次实验只发现了其中的两种，即D Cat.VIⅢ和RHD-CE(2-9)-D，部分D多是由于RHD基因一部分被相应RHCE基因部分替换形成的RHD/CE融合等位基因，理论上，这个分子基础足以对出现部分D的Rh阴性人群的RhCcEe的表达有极大影响，但因本研究中样本量不足，仅从本次数据中无法发现必然联系。每个血型系统的表现均存在地区差异，王志红等人关于Rh系统的血清学研究中显示[15]，Cc，cc抗原组合的标本可能出现D凝集强度减弱或者极弱形成弱D或者Del型，甚至D抗原不表达形成D阴性的现象，本室本次检测则发现，在存在RHD（+）的等位基因但血清学实验为RhD阴性的20例标本中，共有7例显示为CC，排除地区差异，这提示江西地区的RHD基因与RHCE基因间的关系或可做更进一步研究。而随着研究样本数量的增加，我们将发现越来越多的D的基因型及分子背景，这对于安全输血和遗传学的研究都具有重要的价值。

所有研究的目的都是为临床服务，本次检测的111名RhD阴性的献血者，其CcEe抗原的出现的频率依次为 e（111/111）、c（106/111)、C(44/111)、E(6/111)，这提示随着临床输血技术的提高，检测Rh阴性献血者的表型相当有必要，因为一旦患者产生抗-e，寻找合适的供血者将是非常艰难的，本次试验还提示我们，D抗原的表达多种多样，有不同的分子基础，易与相关抗原互相影响，在日常工作中可能误判，应当给予足够重视，必要时采取基因学方法，确认正确的分型。