辅助性T细胞22及其效应分子在肝细胞癌中的检测及意义

郝猛，李观华，施珍

(九江市第一人民医院检验科，江西 九江332000)

辅助性T细胞 （Th细胞）是T细胞的一个亚群，能够辅助T、B淋巴细胞参与机体的免疫应答，其作用是通过分泌细胞因子来实现的；参与炎症反应、免疫应答、损伤修复、细胞增殖与分化等生理病理过程。Th22是新近发现的一类Th细胞，以仅分泌IL-22，而不分泌IL-17和干扰素-γ(IFN-γ)为特点。有研究表明，Th22细胞与自身免疫性疾病、感染性疾病等病程的免疫过程有关；最近研究证实，Th22细胞及其效应分子存在多种肿瘤组织中分布和表达[1]。原发性肝癌的病因机制仍未明确，目前认为其主要影响因素包括肝硬化、病毒性肝炎、遗传因素、饮用水污染和黄曲霉毒素等，肝细胞癌（HCC）大多数以合并乙型肝炎病毒感染和肝硬化为特点，且一致认为乙肝病毒(HBV)长期慢性感染是诱导肝细胞癌的发生的主要因素。近年来，肝细胞癌的常规治疗效果差，免疫治疗成为肝细胞癌的研究热点，研究发现，Th细胞在肝细胞癌的进展中起重要作用，因而研究肝细胞癌发生、发展过程中Th细胞及其效应分子水平变化可以为肝细胞癌的临床治疗提供理论依据和新的途径，为肝细胞癌的防治提供帮助。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2016年8月-2017年11月九江市第一人民医院消化内科住院临床诊断肝细胞癌患者38例、慢性乙型肝炎患者45例和体检科健康者26例外周血标本；患者诊断均符合2012年欧洲肝脏病协会修订的《原发性肝细胞癌管理指南》[2]和2015年我国修订的《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[3]。肝细胞癌组中男性22例，女性16例，平均年龄为50.92±11.21岁，包括乙型肝炎病毒阳性患者28例；慢性乙型肝炎组中男性26例，女性19例，平均年龄为49.32±12.81岁。另收集26名健康对照组的外周血，其中男性16例，女性10例，平均年龄为52.16±11.82岁。

1.2 检测方法

1.2.1 仪器与试剂 购自美国BD公司的FACSCalibur流式细胞仪及购自BD公司的抗人CD4、γ-干扰素、IL-17和IL-22抗体的检测试剂；Hyelone公司提供的完全培养基RPMI 1640；淋巴细胞刺激液[离子霉素和佛波酯(美国eBioscience公司)、布雷菲德菌素 A(美国 BD公司)]；γ-干扰素、IL-17和IL-22检测的ELISA试剂盒分别购自美国Biosource公司、PeproTech公司和R&D公司以及由上海科华提供的ST360酶标仪；采用罗氏Cobas e601化学发光仪及原装配套检测试剂。

1.2.2 流式细胞术(FCM)检测Thl、Th17和Th22细胞亚群比例 取500μl全血和500μl 1640培养基(含10%FBS)混匀，加入淋巴细胞刺激混合液3μl（含佛波酯、离子霉素和布雷菲德菌素A），37℃、5%的CO2培养箱中培养4h。取上述培养标本200μl，加入 CD4 抗体充分混匀，4℃避光 30min。加入500μl固定通透液，充分混匀，4℃避光，20min；1250r/min离心5min，弃上清液，加入红细胞裂解液，混匀，室温避光温育10min。1250r/min离心5min，弃上清液加人700μl通透液充分混匀，4℃，避光，10min，1250r/min 离心 5min，弃上清液，加入γ-干扰素、IL-17和 IL-22抗体，充分混匀，4℃，避光，30min加入700μl通透液洗，采用FACSCalibur流式细胞仪进行上机检测，应用Flow Jo7.6.1软件进行分析。

1.2.3 γ-干扰素、IL-17、IL-22、AFP、CEA、CA199、CA125的检测 γ-干扰素、IL-17和IL-22分别采用美国Biosource公司、PeproTech公司和R&D公司 ELISA 试剂盒检测；AFP、CEA、CA199、CA125均采用罗氏Cobas e601化学发光仪及配套检测试剂检测。

1.3 统计学方法 运用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计量数据以均数±标准差（）表示。采用独立t检验分析各组间差异，采用Spearman检验分析Th22细胞频数与相关临床项目的相互关系；P值＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Thl细胞、Th17细胞和Th22细胞在各组外周血中频数分布比较 HCC组和CHB组患者Thl细胞频数分别为15.61%±8.86%和17.91%±8.91%，均明显低于健康对照组的21.95%±8.07%，差异均具有统计学意义（P值均＜0.05）；而HCC组与CHB组无统计学差异。HCC组Thl7细胞频数为3.01%±1.29%，健康对照组为2.05±0.89%，两组比较差异均具有统计学意义 （P＜0.05）；CHB组患者Thl7细胞频数为2.21±1.03%，与健康对照组的比较差异无统计学意义(P＞0.05)；同时HCC组与CHB组比较有统计学差异(P＜0.05)。HCC组和CHB组患者Th22细胞频数分别为 1.72%±0.82%和 1.36%±0.78%，较健康对照组的0.96%±0.51%明显升高(P值均＜0.05)；HCC组与CHB组间差异具有统计学意义(P＜0.05)。 见图 1。

图 1 Thl、Th17 和 Th22 在各组外周血中的频数分布

2.2 γ-干扰素、IL-17和IL-22在各组血浆中水平比较 γ-干扰素在HCC组、CHB组血浆水平为(19.16±8.68)pg/ml、(25.56±9.98)pg/ml， 比较差异具有统计学意义 （P＜0.05），且均高于健康对照组的(12.89±6.58)pg/ml，差异均具有统计学意义 （P值均＜0.05）。IL-17在HCC组、CHB组血浆水平分别为(69.91±32.01)pg/ml、(63.13±31.73)pg/ml，比较差异无统计学意义（P＞0.05），但均高于健康对照组的(48.97±23.69)pg/ml，差异均具有统计学意义（P 值均＜0.05）。IL-22在HCC组、CHB组血浆水平分别为(35.67±23.21)pg/ml、（24.06 土 12.99）pg/ml，比较具有统计学意义（P值＜0.05）；均高于健康对照组的（14.99 士 8.49）pg/ml，差异均具有统计学意义（P值均＜0.05）。 见表 1。

2.3 肝细胞癌组Th22细胞与Thl、Th17细胞亚群表达频数的相关性 HCC患者外周血中Th22细胞频数与 Thl7细胞频数呈正相关 (r=0.639，P=0.013）。而Th22细胞频数与Thl细胞频数无明显相关性(r=0.078，P=0.717)。 见图 2。

表1 γ-干扰素、IL-17和IL-22在各组血浆中水平比较（)

表1 γ-干扰素、IL-17和IL-22在各组血浆中水平比较（)

注：与对照比较：*P＜0.05差异具有统计学意义；与CHB组比较：△P＞0.05，差异无统计学意义。

组别 例数（n）HCC组CHB组对照组38 45 26 γ-干扰素(pg/ml)19.16±8.68*25.56±9.98*12.89±6.58 IL-17(pg/ml) IL-22(pg/ml)69.91±32.01*△63.13±31.73 48.97±23.69△35.67±23.21*24.06土12.99*14.99士8.49

图2 肝细胞癌（HCC）外周血中Th17频数与Th22频数表达的相关性

2.4 肝细胞癌组Th22细胞频数与IL-22血浆水平、血浆肿瘤标志物相关分析 结果发现肝细胞癌组外周血Th22细胞频数和IL-22血浆水平存在明显正相关（r=0.338，P=0.023），而 Th22 细胞频数与肿瘤标志物 AFP、CEA、CA199、CA125均无相关性（P＞0.05）。 见表 2。

表2 HCC组Th22细胞与血浆IL-22、血浆肿瘤标志物相关分析（n=38）

2.5 肝细胞癌组中HBV携带者与未携带者Th22频数、IL-22水平比较 HBV携带肝细胞癌患者与HBV未携带肝细胞癌患者外周血Th22频数水平比较差异具有统计学意义（r=0.602，P=0.025）；HBV携带肝细胞癌患者与HBV未携带肝细胞癌患者外周血IL-22水平比较差异具有统计学意义 （r=0.574，P=0.038）。

3 讨论

Th22细胞是学者们最近发现的CD4+T细胞功能亚群，其表达 CCR6、CCR4和 CCRl0，是仅以产生IL-22为主，但是不产生IFN、IL-4和IL-17，是独立于Thl、Th2和Th17的一类细胞亚群。Th22细胞由Duhen等[4]和 Trifari等[5]最早于2009年发现的，是一类与皮肤免疫功能存在密切关系的CD4+T细胞功能亚群，其功能主要是通过IL-22发挥作用。IL-22属于IL-10细胞因子家族，主要由Th22细胞和Thl7细胞亚群产生，其中Th22细胞分泌量可占总IL-22分泌量的65%左右；IL-22介导其影响通过异源二聚体跨膜受体复合物组成IL-22R1和IL-10R2，随后激活Janus激酶信号转导子和转录激活子（JAK-STAT）信号通路，包括STAT3的JAK1和TYK2[6]。STAT3磷酸化、下游基因Bcl-2和Bcl-XL上调、细胞周期蛋白D1和血管内皮生长因子(VEGF)均促进肿瘤的生长和转移[7]。STAT3介导的T细胞扩张和Thl7细胞的增殖是促进肿瘤生长的关键[8]。在肝脏STAT3被激活后会诱导抗菌蛋白因子、急性时相因子、凋亡抑制因子和增值相关因子等的表达，因此我们都认为IL-22有表现为保护肝脏、促进肝细胞有丝分裂、甚至是促进肿瘤形成等作用[9-11]。IL-22的作用受体广泛分布于皮肤、肝脏、肾脏、呼吸道及消化道等组织细胞中，主要是通过对组织细胞的作用来参与这些系统疾病的病理发生过程[12]。IL-22在皮肤的防御中发挥着重要的作用，并且在病毒和真菌感染中也起着相应作用；除感染性疾病外，IL-22在自身免疫性疾病，如银屑病、Crohn'S疾病、溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎等疾病中表达水平均有所上调。Jiang等的研究显示，肝癌微环境中高表达的IL-22会促进肿瘤的生长，抑制细胞凋亡，促进肿瘤转移通过STAT3的活化[13]。康瑜[14]等研究表明在慢性肝病和肝硬化患者中Th22细胞血浆表达水平明显增高，提示Th22细胞及效应分子参与了慢性肝炎肝硬化的发生发展过程，进一步推测肝细胞癌和慢性肝病发生的T细胞介导中与Th22细胞的免疫效应可能相关。在我们的实验中也发现肝细胞癌组、慢性乙型肝炎组中外周血Th22频数和IL-22血浆水平均显著高于健康对照组，更重要的是，我们还观察到血清IL-22水平与HCC患者中Th22细胞频数相关，我们由此推测，Th22细胞通过产生IL-22促进肝细胞癌的发病机制。

目前Th22细胞在肝癌中的研究还不多见，仅有许秀华[15]等研究认为Th22细胞与Th1、Th17和Treg细胞一样均参与了原发性肝癌的发病进展，外周血Th22细胞频数表达与肝肿瘤直径呈正相关。但Th22细胞与IL-22在其他肿瘤中的研究有相关报道，Sun等[16]的研究认为在直肠癌中Th22细胞可通过影响STAT3信号通路而控制结肠肿瘤的增长速度，促进肿瘤的生长；雷波等[17]的研究认为Th22细胞和IL-22在卵巢癌组织呈高水平表达，且与肿瘤分期呈正相关；另外Th22细胞及其效应分子在肺癌、宫颈癌、胰腺癌中的作用也有相关的报道。

有研究已证实HCC发病及进展中也存在其他CD4+T细胞亚群或相关细胞因子失衡。Thl细胞主要发挥抑制肿瘤的作用，HCC患者早期癌组织与外周血Th1细胞频数表达明显升高，而中晚期出现下降。本研究发现HCC外周血Th1细胞频数均低于健康对照者和CHB组，主要考虑是因为HCC患者病例以晚期占多数。此外，我们还发现，肝细胞癌患者Th17细胞频率也明显高于健康对照组，且HCC患者外周血中Th22细胞与Thl7细胞频数呈正相关 (r=0.639，P=0.013），提示Th22细胞与Th17细胞在肝细胞癌的发病机制中的有协同效应，但其协同效应仍不清楚，需要进一步研究。有试验者将猿人类免疫缺陷病毒 （SHIV）感染猕猴后，发现在SHIV慢性感染后再次感染疟疾时Th22细胞的表达水平较SHIV与疟疾共同感染时高出200多倍，并与其预后明显有关[18]，由此推测Th22表达水平与病毒感染存在一定的相关性；与本研究中CHB组Th22细胞频数明显高于健康对照组，HBV携带肝细胞癌患者Th22细胞频数明显高于HBV未携带肝细胞癌患者相一致。虽然Th22细胞有促进再生的作用，但我们实验并未发现与诊断HCC再生的经典指标—AFP有明显相关性，这可能与两者刺激分泌的路径不同有关。

Th22细胞及其效应分子参与了肝细胞癌的发病发展过程，为肝细胞癌的发病机制提供新的线索，未来更多的研究探讨Th22细胞与肝内微环境间的相关作用，为促进辅助性T细胞亚群及相关因子在肝细胞癌中的免疫治疗发展提供依据。