胰酶稀释法提取乳鼠原代海马神经元*

康杨婷， 王丽琨， 伍国锋***

(1.贵州医科大学， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学附院 急诊神经科， 贵州 贵阳 550004)

海马区域在学习、记忆、认知等高级神经功能活动中有着至关重要的作用[1-5]，疾病累及海马组织常可导致癫痫、阿尔茨海默病等相关疾病。文献报道，海马神经元的培养多采用多聚赖氨酸提前24 h包被、胰蛋白酶消化、含血清培养和阿糖胞苷处理的方法[6-8]，既往相关实验方法均有神经元细胞难以存活、杂质细胞多等缺点[9]，本研究采用胰酶稀释法分离海马神经元，以含有1% B27的Neubasal培养基进行无血清培养，对比未稀释胰酶的培养方法，该法获得了生长良好、纯度较高、数量更多的海马神经元，为神经、精神系统疾病的研究提供了足够和高质量的细胞模型，报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物

出生24 h内SD乳鼠，雌雄不限，体质量为3～6 g，普通(SPF)级，由贵州医科大学动物实验中心提供。

1.2 主要试剂与仪器

胎牛血清(美国SCIENCELL 公司)、多聚赖氨酸(美国Sigma 公司)、0.25%胰酶消化液(美国HyClone 公司)、DMEM/ F12(美国 Hyclone 公司)；Neurobasal 培养基(美国 Gibco 公司)、L-Glutamine(美国索莱宝公司)、B27(美国Gibco 公司)、封闭山羊血清(美国索莱宝公司)、神经元特异性烯醇化酶抗体(NSE抗体，上海博奥森公司)、Alexa fluor 488标记的山羊抗兔 IgG(上海博奥森公司)、DAPI染色液(上海博奥森公司)、4%多聚甲醛(美国索莱宝公司)、聚乙二醇辛基苯基醚(美国索莱宝公司)、PBS缓冲液(美国HyClone 公司)、青霉素/链霉素(美国HyClone 公司)及D-Hanks液(美国索莱宝公司)。主要仪器有二氧化碳恒温培养箱、生物安全柜、倒置相差显微镜及荧光倒置显微镜。

1.3 方法

1.3.1多聚赖氨酸包被 多聚赖氨酸(×10)与高压灭菌双蒸水按1∶9稀释，用巴氏滴管吸取已稀释的多聚赖氨酸铺满培养板，置入37 ℃培养箱中放置2～4 h后回收多聚赖氨酸，铺板前用PBS清洗3次备用。

1.3.2溶液配制 种植液：DMEM/F12 42 mL，胎牛血清 7 mL，L-Glutamine 0.5 mL，青霉素/链霉素 0.5 mL。饲养液：Neurobasal 培养基 48 mL，B-27 1 mL，L-Glutamine 0.5 mL，青霉素/链霉素 0.5 mL。0.125%的胰酶消化液：用0.25%的胰酶消化液，加入等体积PBS缓冲液配制0.125%胰酶消化液。

1.3.3海马组织提取 参考文献[10-12]方法提取海马组织，将实验乳鼠用75%的酒精浸泡消毒3～5 min，断头后暴露左右大脑半球、去除表层脑组织后，分离两侧月牙状的海马并置入盛有预冷的D-Hank’s平衡盐溶液中；20倍放大镜下剔除海马的血管及脑膜，再将海马置于冰上装有4 mL种植液的离心管中。

1.3.4分组及处理 实验分为胰酶稀释组和胰酶未稀释组，分别用0.125%及0.25%的胰酶提取海马神经元。胰酶稀释组：提取的海马组织静置2 min后弃掉上清液，用PBS清洗2次，机械吹打20～40次，予1 000 r/min离心 5 min，去掉上清液，加入0.125%胰酶消化，胰酶的量为海马组织的10倍，机械吹打20次，将制备好的细胞悬液加入培养皿中，放入37 ℃孵育箱消化15 min，消化期间每隔5 min摇晃1次培养皿，使组织充分消化。胰酶未稀释组: 将海马组织用PBS清洗2次，去掉上清液，加入0.25%胰酶消化液，其余操作步骤相同。两组均以胎牛血清终止消化，用200目的筛网过滤后离心弃掉上清液制成细胞悬液，按细胞密度为1×109个/L接种，置入37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。先予以种植液培养4～5 h后，更换为饲养液，每3 d半量或1/3量换液，同时观察获得的细胞数量。

1.3.5免疫荧光法鉴定海马神经元及纯度 选取第7天的海马神经元，用多聚甲醛、0.5%Tritonx-10和5% BSA固定、透化、封闭神经元，然后加入1∶200神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗体。次日避光加入1∶200的山羊抗兔IgG标记的二抗，静置2 h后避光加入DAPI，在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光细胞及细胞核。随机选取5个视野，计数其阳性细胞的个数，并计算阳性神经元的百分率，取平均值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0进行统计学分析，两组数据进行统计分析前先进行Levene方差齐性检验，若方差齐，两组变量采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 形态学观察

海马神经元接种到培养板中，可见细胞呈圆形，有明显光晕。胰酶稀释组：接种4～5 h后，约90%以上细胞已经贴壁，镜下细胞呈圆形，少数细胞已长出细小突起。胰酶未稀释组：8～10 h细胞70%以上贴壁，有时甚至延长到72 h才能完全贴壁。细胞贴壁后换用无血清饲养液，1 d后大部分神经元长出1个细小突起；培养2～3 d，神经元的突起变长变粗、突起个数增多、细胞突起出现稀疏网状连接；培养4～6 d，神经元细胞聚集出现紧密的网状连接，细胞的突起增长增多；培养7～9 d，神经元胞体饱满，呈圆形或不规则形，突起分支很多，形成致密细胞网络。在显微镜下对两组细胞进行计数，胰酶未稀释组细胞个数多于胰酶稀释组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

(1)与稀释组比较，P<0.01图1 胰酶稀释组与胰酶未稀释组所获得的海马神经元数(200×)Fig.1 The numbers of primary hippocampal neurons in 0.25% trypsin group and 0.125% trypsin group

2.2 海马神经元纯度

海马神经元培养第7天时，细胞已经成熟，因此本实验选择在第7天时对稀释组细胞进行纯度鉴定。胞体和树突呈现绿色为NSE阳性海马神经元(图2A)，神经胶质细胞、成纤维细胞均不染色，同时用DAPI对细胞核进行蓝染获得细胞总数(图2B)。经鉴定，阳性反应海马神经元的纯度为90%以上。

注：A中绿色荧光为表达NSE阳性的海马神经元，B为经DAPI法蓝染的海马神经细胞核图2 胰酶稀释组海马神经元纯度鉴定(免疫荧光，×200)Fig.2 Identification of primary hippocampal neurons in 0.25% trypsin group

3 讨论

在神经精神疾病的研究中已经广泛地应用海马神经元作为细胞模型，尤其是在神经系统疾病如AD、癫痫、脑血管疾病研究中尤其重要。但是神经元的培养仍然存在杂质细胞多、生长状态差等问题。由于神经元在体外培养存活时间短，而且生长缓慢，如何得到纯度高、活力好和体外存活时间长的神经元仍然是一个值得探讨的难题。神经元在海马组织中聚集，为获得纯度高、杂质少的神经元常优先选择海马区域作为取材部位。

神经元是高度分化的细胞，一般只作原代贴壁培养，因此神经元接种后的贴壁情况对于它的存活有着关键作用。由于神经元不具有良好的贴壁能力，因此需要提前在培养板表面添加可加强细胞贴壁的物质以改变培养板上的电荷，使细胞更易于结合贴附，特别是需要长期培养细胞完成后续研究的实验[15-16]。大部分文献中多采用多聚赖氨酸包被培养板[17-18]。在以往的研究中发现大部分以采用胰蛋白酶消化海马组织[19-20]，但是胰蛋白酶消化的浓度及时间影响神经元提取质量。海马神经元的分离方法有多种，本实验采用将胰蛋白酶的浓度稀释一半后消化海马，所得海马神经元比未稀释组细胞数目多，存活率高，生长状态良好。本实验终止消化使用的是4 mL FBS，终止消化后过滤未完全消化的组织碎片。实验中先用14%胎牛血清的 DMEM/12将细胞制备为细胞悬液，细胞贴壁后4～5 h更换无血清培养基[21]饲养细胞。主要原因：(1)含有血清的培养基在铺板初期可促进神经元快速贴壁[22]，一般接种4～5 h后神经元细胞已贴壁牢固，而胶质细胞贴壁能力强但贴壁速度缓慢，因此通过贴壁时间差和及时更换无血清培养液可在一定程度上减少杂质细胞，使海马神经元的纯度更高；(2)Neuralbasal培养基是一种专用于神经元生长的特殊培养基，含有抑制胶质细胞生长的成分，因此实验中未使用阿糖胞苷，可减少对神经元的损伤作用，有利于海马神经元保存良好的生长状态；(3)B27中含有谷酰胺、转铁蛋白等细胞生长所必需的营养因子[23-24]，尤其是含有多种适宜神经元生长的营养因子；(4)饲养液中Neuralbasal培养基、谷氨酰胺与B27配置使用能够更好地促进神经元细胞的生长，抑制杂质细胞如胶质细胞的生长，从而提高神经元的纯度和活性。

通过对原代海马神经元的培养，总结出以下经验： (1)稀释胰酶法可减少胰酶消化液对神经元的损害，细胞纯度更高、生长状态良好；胰蛋白酶相较木瓜酶、Accutase酶更具有经济效益；(2)全部操作过程应在冰上进行，冰上操作降低脑组织代谢率，减少细胞的损伤，提高神经元的存活率，尽量剥离海马组织表面的脑膜及血管，因为脑膜和血管剥离不干净可减少神经元数量以及增加杂质细胞如胶质细胞及成纤维细胞等；(3)虽然胶质细胞贴壁能力强，但贴壁速度较缓慢，故在细胞接种后4～5 h更换为无血清培养基，以通过差速贴壁来去除胶质细胞，增加神经元的纯度；(4)稀释的胰酶消化液的需要量为海马组织体积的10倍，而且稀释胰酶法消化海马组织更加温和，一般在15 min左右，不宜过长，每5 min摇晃1次，使组织与胰蛋白酶充分接触，使组织充分消化；(5)神经元接种密度应控制在1～10×109个/L，细胞密度低，细胞间隙增大，神经元之间缺乏营养支持无法形成网络正常生长，细胞过密使培养基中营养物质消耗过快，从而导致神经元之间产生接触抑制。

通过该实验方法可获得纯度高、状态良好的原代海马神经元，而且试剂的配置及操作相对简单，为以海马神经元为基础细胞模型的神经系统相关疾病提供了实验基础。