Isogarcinol对人红白血病细胞HEL的抗肿瘤作用及机制*

陈 丽， 杨 珏， 邱剑飞， 苑春茂， 吴昌学， 李艳梅**， 郝小江**

(1.贵州中医药大学， 贵州 贵阳 550002； 2.贵州省中科院天然产物化学重点实验室， 贵州 贵阳 550014； 3.贵州医科大学， 贵州 贵阳 550025)

白血病是造血系统常见的恶性肿瘤，是严重危害人类健康的恶性疾病之一，化疗是治疗白血病的主要手段。传统的化疗药物在杀伤白血病细胞的同时，对人体正常细胞也产生较强的毒副作用，容易导致化疗失败[1-3]。急性髓系白血病(acute myeloid leukaemia,AML)是一组造血干或祖细胞异常的克隆性恶性疾病，其典型特征为白血病克隆细胞成熟分化障碍而停滞在细胞发育阶段，且伴随凋亡抵抗和恶性增殖[4]。长期以来，AML细胞对化疗药物的凋亡抵抗是导致化疗失败和疾病复发的根源[5]。新的药物和化疗方案在一定程度上改善了这种局面，因而急性早幼粒细胞白血病有望获得治愈。然而，大多数急性髓系白血病亚型的治疗，在目前仍然困难重重[6]。已报道AML的发生与染色体易位、基因突变等多种因素有关，其致病机制尚未完全阐明[7]。HEL(human erythroleukemia)细胞是1982年从红白血病患者的外周血中分离的红白血病细胞，经证实含有JAK2V617F突变。HEL细胞在受到不同诱导因素的刺激时，有向红系、单核巨噬系或巨核系多向分化的潜能，因此具有很重要的研究价值[8]。本研究采用不同浓度本课题组前期分离和鉴定的化合物Isogarcinol处理白血病细胞系HEL细胞[9]，探讨 Isogarcinol对白血病细胞的凋亡和增殖的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

Isogarcinol是本课题组前期分离和鉴定的化合物[9]，结构式如图1。溶解于DMSO(二甲基亚砜)，储存浓度为20 mmol/L，-20 ℃保存备用。RPMI 1640培养液、胎牛血清购自美国HyClone公司。Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自美国BD公司，HiFiScript cDNA合成试剂盒和UltraSYBR混合物购自cwbiotech(中国北京)。引物由Invitrogen(中国上海)制备，PARP、Cleaved PARP、ERK 1/2和p-ERK 1/2等抗体均购自美国CST公司。流式细胞仪为美国BD公司产品，实时荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。

图1 Isogarcinol的化学结构Fig.1 Chemical structure of Isogarcinol

1.2 方法

1.2.1细胞培养 HEL细胞来自加拿大多伦多大学，用RPMI 1640完全培养液(含有10%胎牛血清)，置于37 ℃、5% CO2的培养箱内培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2MTT法检测化合物IC50值 取对数期细胞，离心，用10 %胎牛血清的新鲜培养基重悬，按每孔8 000个细胞数接种于96孔板中，按浓度梯度为20、10、5、2.5、1.25 μmol/L加入Isogarcinol化合物，DMSO为空白对照，放入培养箱中培养72 h，每个浓度设置4个复孔。用显微镜采集图片，离心，去除细胞培养液，加入10 μL含10% MTT的新鲜培养液，继续培养4 h后，离心去除上清液，每孔加入160 μL的DMSO，室温震荡15 min，在490 nm光激发下用酶标仪测吸光度(OD)值。

1.2.3细胞生长曲线测定 取对数期生长细胞，离心，用10%胎牛血清的新鲜培养基重悬，按每孔8 000个细胞数接种于96孔板中。待细胞稳定，加入浓度梯度为15、10、5 μmol/L的Isogarcinol化合物，DMSO为空白对照。采用细胞计数板计数12、24、36、48、72 h的细胞数，并绘制细胞生长曲线。每个实验重复3次。

1.2.4流式细胞术分析细胞凋亡 利用Annexin V/PI双染法通过流式细胞术检测HEL凋亡的情况。用DMSO作对照，加入浓度梯度为15、10、5 μmol/L的化合物Isogarcinol处理12、24、48 h，计数每106个细胞用100 μL 1×binding buffer重悬，每100 μL 1×binding buffer各加入5 μL的Annexin V和PI染液，室温避光孵育15 min，离心去除染液，用200 μL 1×binding buffer重悬，通过流式细胞分析仪上机检测。

1.2.5RNA提取和实时定量RT-PCR(qRT-PCR) 将对数生长期HEL细胞以3×108/L浓度接种于6孔培养板中。培养24 h后，分别加入Isogarcinol终浓度为5、10、15 μmol/L，对照组加入等量的DMSO。24 h后用Trizol试剂提取总RNA，将各孔裂解液吸到EP管中，加入氯仿，用力振摇。室温下孵育2～3 min，离心后，转移上层无色液体至新EP管中。加入异丙醇0.5 mL，混匀。20 ℃下孵育10 min，离心弃上清，沉淀加入75%乙醇1 mL，用枪吹打均匀，离心后加入DEPC水溶解。用 cDNA反转录试剂盒合成cDNA，-80 ℃保存备用。以反转录cDNA为模板，β-actin为内参，荧光实时定量RT-PCR扩增c-Myc、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8基因，引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 The sequences of primers were used in this study

1.2.6Western blot实验 将对数生长期的HEL细胞以3×108/L浓度接种于6孔培养板中。培养24 h后，分别加入Isogarcinol终浓度为5、10、15 μmol/L，对照组加入等量的DMSO。24 h后离心收集细胞沉淀，加入预冷的裂解液，冰上裂解细胞30 min，于4 ℃ 12 000 r/min，离心12 min。取上清，即得到细胞总蛋白质。用BCA试剂盒测定蛋白质浓度，加入5×SDS上样缓冲液，100 ℃热变性10 min。按相等上样量进行SDS-PAGE，随后在冰浴条件下进行湿转。转移完成后用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗PARP、cleaved PARP、ERK 1/2、p-ERK 1/2、Bax、Bad、p -Stat3、stat3、c-Myc、cleaved caspase-3、Capase-3、cleaved caspase8、Capase-8、Bcl-2、JAK2和β-actin孵育，4 ℃摇床孵育过夜。TBST洗膜3次，加辣根过氧化物酶标记二抗室温作用2 h，TBST洗膜3次，然后用LI-COR进行扫膜。

1.2.7小鼠体内实验 4～5周龄的SCID小鼠购自北京华盛康盛科技有限公司，动物雌雄各半。随机分为生理盐水组(Blank)、DMSO对照组、给药组按小鼠体质量5、2.5 mg/kg Isogarcinol，腹腔注射给药，每两天注射1次，共注射7次，统计小鼠的存活时间和体质量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Isogarcinol对人红白血病细胞系HEL活性及增殖能力影响

如图2，通过MTT细胞活力测定Isogarcinol对HEL的活性，结果显示，Isogarcinol对HEL细胞具有杀伤作用，在Isogarcinol浓度达到10 μmol/L时，抑制率达到85%，进一步计算得出其IC50值为5.4 μmol/L。同时通过显微镜观察发现Isogarcinol对HEL的细胞形态有影响；提示Isogarcinol能抑制HEL的细胞活性，同时用Isogarcinol(0～15 μmol/L)处理细胞12、24、36、48、72 h后，采用细胞计数法绘制细胞生长曲线，显示出Isogarcinol显著抑制HEL细胞的增殖。

2.2 Isogarcinol诱导人红白血病细胞系HEL凋亡

采用流式细胞仪分析了Isogarcinol处理后HEL细胞的凋亡，结果显示，不同浓度Isogarcinol处理后，HEL细胞中凋亡细胞群中存在显著的剂量和时间依赖性(图3)。在Isogarcinol>10 μmol/L时，细胞凋亡率与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或<0.01)。

2.3 Isogarcinol在RNA水平上调控凋亡相关基因的表达

qRT-PCR结果显示，Isogarcinol处理HEL细胞后，促凋亡基因Bax的表达增加，Caspase-3、Caspase-8的表达下调，抗凋亡基因Bcl-2、c-Myc的表达下调(图4)。

注：A和B示Isogarcinol对人红白血病细胞系HEL细胞活力和形态变化的影响，C示Isogarcinol抑制HEL增殖图2 Isogarcinol对人红白血病细胞系HEL细胞活性及增殖的影响Fig.2 The effect of Isogarcinol on viability of HEL cells

与对照组同时点比较，(1)P<0. 05，(2)P<0.01图3 Isogarcinol诱导人红白血病细胞系HEL细胞凋亡Fig.3 Isogarcinol induced HEL cell apoptosis

与对照组比较，(1)P<0.05图4 Isogarcinol调控人红白血病细胞HEL中相关凋亡基因的表达(qRT-PCR)Fig.4 Effect of Isogarcinol on the mRNA expression levels of apoptosis-related genes

2.4 Isogarcinol通过调节JAK2/Stat3以及凋亡蛋白的表达，诱导人红白血病细胞HEL的凋亡

为了阐明Isogarcinol诱导HEL细胞凋亡可能的机制，本研究通过Western blot检测了Isogarcinol处理后HEL细胞裂解液中JAK2/Stat3及相关凋亡蛋白的表达。结果显示,与对照组比较，Isogarcinol各浓度组Bad、Bax、cleaved caspase3、cleaved caspase8和cleaved PARP的相对表达量呈浓度依赖性上调，而Bcl-2、caspase3、caspase8、PARP、p-Erk及c-Myc的相对表达量呈浓度依赖性下调(图5)。提示Isogarcinol能够下调JAK2及p-Stat3 蛋白水平的表达，可能Isogarcinol通过调节JAK2/ Stat3信号通路进而影响下游相关凋亡蛋白表达，从而诱导HEL细胞发生凋亡。

图5 Isogarcinol通过调控JAK2/Stat3途径中关键蛋白以及凋亡蛋白表达而诱导细胞凋亡Fig.5 The effect of Isogarcinol on the expression levels of part of genes in JAK2/Stat3 pathway and apoptosis-related genes

2.5 Isogarcinol延长白血病小鼠存活时间，提高血红细胞比容

体内实验结果表明，与对照组相比，Isogarcinol显著延长了小鼠的存活时间，并且增加了血红细胞比(图6)，表明Isogarcinol能够在体内抑制白血病的发生及发展。

与对照组比较，(1)P<0.05图6 Isogarcinol延长白血病小鼠存活时间并提高血红细胞比容Fig.6 Isogarcinol prolonged the survival of HEL tumor-bearing mice and increased hematocrit

3 讨论

目前白血病的治疗手段主要有化疗、放疗、造血干细胞移植、生物靶向治疗、细胞免疫治疗等。然而，目前的治疗手段仍远远不能满足临床需求，白血病的治疗难度依旧很大，由此带来的家庭及社会负担依旧很重。因此，迫切需要寻找新的治疗方法和药物[10-17]。AML 是一种造血干细胞的恶性克隆性疾病。AML 可由髓系细胞分化发育过程中造血干细胞或造血祖细胞恶性转化而来，也可继发于化疗、放疗或由其他疾病如骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)、骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasm,MPN)演变而来，继发性AML 在分子遗传特性上与原发性AML 不同且临床预后较差[18]。在AML中有很大一部分病例发生基因突变从而导致了相应信号转导通路的异常，在原发性AML 中，FLT3、NPM1、DNMT3α等是常见的突变[19]， 而在继发于MPNs 的AML中，JAK2、TENT、IDH1/2、ASXL1 等突变常见，JAK2-STAT 信号通路异常活化在AML 发生中有重要作用[20]。

JAK是一类非受体酪氨酸激酶，它可以通过细胞因子或生长因子与相应受体结合而被激活。JAK家族有包括JAK1、JAK2、JAK3及TYK2。JAK与细胞因子之间不存在个体对应，这表明JAKs各家族成员可以通过一种细胞因子被激活，并且几种不同的细胞因子也可以激活同一JAK[21]。STATs是一类可以与脱氧核糖核酸(DNA)结合的特殊蛋白家族。STAT家族包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5和STAT6。JAK被诱导磷酸化后，活化STAT以形成二聚体，使STAT以二聚体形式进入细胞核并调节靶基因的表达[22]。JAK-STAT信号通路参与多种生理调节过程，涉及细胞的生长、分化，造血以及免疫功能等[23]。近年来，在血液系统肿瘤中研究发现，JAK-STAT通路在白血病、淋巴瘤及骨髓增殖性肿瘤的发病中具有重要作用[24]。Seido Oku通过干扰RNA阻断JAK2-STAT5通路发现，存在JAK2V617的MPN细胞增殖明显受到抑制，认为JAK2V617F可磷酸化下游STAT3通路[25]。

本实验通过研究Isogarcinol对HEL细胞增殖及凋亡的影响，结果显示：Isogarcinol作用于HEL细胞后，与DMSO对照组相比，显著抑制HEL细胞的增殖。流式细胞术结果显示，Isogarcinol处理HEL细胞12、24、48 h后，随着Isogarcinol浓度的增加和作用时间的延长，Isogarcinol组HEL细胞出现明显凋亡。实时荧光定量PCR结果显示，促凋亡基因Bax明显上调，而Bcl2、caspase3、caspase8、PARP及c-Myc显著下调。蛋白质免疫印迹结果显示，Isogarcinol作用于HEL细胞24 h，发现JAK2、p-Stat3、Bcl2、caspase3、caspase8、PARP、p-Erk和c-Myc相对表达量呈浓度依赖性的下调。Bad、Bax、cleaved caspase3、cleaved caspase8及cleaved PARP的相对表达量呈浓度依赖性的上调。动物体内实验结果表明，Isogarcinol小鼠组与DMSO对照组比，显著延长了小鼠的存活时间，并且增加了血红细胞比，表明Isogarcinol能够在体内抑制白血病的发生及发展。以上实验结果表明：Isogarcinol可显著抑制HEL细胞增殖，诱导细胞凋亡，可以得出结论：Isogarcinol可以通过抑制JAK2/Stat3信号通路，导致参与细胞凋亡的基因出现明显变化，并且诱导细胞凋亡。