白色链霉菌ε-聚赖氨酸合酶的异源表达及重组菌全细胞合成ε-聚赖氨酸的条件优化

ITUZE KUBANA Marie Claudine，乔郅钠，徐美娟，陈旭升，杨套伟，张显，邵明龙，饶志明

(江南大学 生物工程学院， 江苏 无锡，214122)

ε-聚赖氨酸是一种L-赖氨酸均聚物，主要由链霉菌属和一些丝状真菌分泌产生[1-2]。由于ε-聚赖氨酸具备易被生物降解、可食用、对人体和环境无毒无害等特点而广泛应用于食品和医药行业[3-5]。近几年，人们对ε-聚赖氨酸的研究也越来越多，但大多都是针对ε-聚赖氨酸生产菌株进行发酵条件优化(包括培养基优化[6]、营养物质流加[7]、pH调控[8]等)和菌株育种改造(物理和化学诱变[9-10]、核糖体工程[11]、等离子诱变和基因组改组[12])等策略来改善ε-聚赖氨酸的产量。利用白色链霉菌直接进行发酵来实现ε-聚赖氨酸的生产是最为常用的方法，如REN等利用发酵培养基优化和两阶段pH控制策略，对Streptomycessp.M-Z18进行5 L发酵罐补料分批发酵192 h，其ε-聚赖氨酸产量高达54.7 g/L[8]。虽然其ε-聚赖氨酸产量很高，但发酵周期长，且发酵液成分复杂，不利于ε-聚赖氨酸的分离纯化。

利用全细胞作为催化剂进行目标产物的生产已成为一种趋势，这种方法成本低、易操作，而且副产物少、有利于分离纯化。目前，ε-聚赖氨酸的生产菌株大多是白色链霉菌，白色链霉菌是非食品安全性菌株，而ε-聚赖氨酸主要用于食品和医药行业，故其产品安全性问题令人堪忧[13-14]。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种经美国食品药品监督管理局批准的GRAS菌株，常用作细胞工厂进行重组蛋白、氨基酸和化学品等的生产[15-16]，且目前仅有一项研究是利用Bacillussubtilis进行ε-聚赖氨酸的生产，其产量仅达76.3 mg/L[17]。

考虑到ε-聚赖氨酸产品的安全性问题，本研究克隆了经密码子优化的白色链霉菌Streptomycesalbulus来源的ε-聚赖氨酸合酶编码基因pls，成功实现了ε-聚赖氨酸合酶在食品安全性菌株Bacillussubtilis168中的异源表达，获得了B.subtilis168/pMA5-pls重组菌株。针对B.subtilis168/pMA5-pls重组菌株全细胞催化生产ε-聚赖氨酸的催化体系进行了优化，结果表明，在L-赖氨酸产量为0.5 g/L, 初始pH和温度分别为3.0和30 ℃条件下，转化4 h，ε-聚赖氨酸的产量达到195.1 mg/L，远高于已报道的B.subtilis直接发酵生产的ε-聚赖氨酸产量。本研究构建的全细胞催化体系为食品级ε-聚赖氨酸的生产提供了一种新的策略。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

本研究中所用到的菌株EscherichiacoliJM109、Bacillussubtilis168、MycobacteriumneoaurumVKM Ac-1815D以及质粒pMA5，均为本实验室保藏；pET28a-pls质粒，苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.2 实验试剂

NdeI、BamH I限制性内切酶和10 000 bp核酸marker等，大连宝生物公司；高保真酶、同源重组酶克隆试剂盒，南京诺维赞生物科技有限公司；小量质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，上海捷瑞生物工程有限公司；L-赖氨酸和ε-聚赖氨酸，Sigma公司；二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)、洗涤剂NP-40和BHI培养基，上海阿拉丁有限公司。

1.1.3 培养基与缓冲液

LB培养基(g/L)：蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10，固体培养基则加入1.5%～2.0%(质量分数)的琼脂粉，根据需要加入相应浓度的抗生素。

M3G发酵培养基(g/L)：葡萄糖60、酵母提取物10.5、(NH4)2SO415、K2HPO23.5、MgSO4·7H2O 1.25、ZnSO4·7H2O 0.1和FeSO4·7H2O 0.02。

BHI培养基：根据配方说明,按照36.5 g/L进行配置。

缓冲液A：100 mmol/L Tris-HCl，20%甘油(体积分数)，2 mmol/L 乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，0.2 mol/L NaCl和5 mmol/L DTT，pH 8.0。

缓冲液B：50 mmol/L Tris-HCl，20% 甘油(体积分数), 1 mol/L NaCl和 5 mmol/L DTT，pH 8.0。

缓冲液C：10 mmol/L 三羟甲基甲胺基丙磺酸(N-[Tris(hydroxymethyl)metyl]-3-aminopropanesulfonic acid,TAPS)-NaOH， 5 mmol/L MgCl2，0.5 mmol/L 腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)， 0.1 mmol/L DTT，2 g/L NP-40， 10%甘油(体积分数)，pH 8.5。

1.2 实验方法

1.2.1 ε-聚赖氨酸合酶编码基因pls的克隆

将NCBI数据库查询到的S.albulus来源的ε-聚赖氨酸合酶编码基因pls序列提交至苏州金唯智生物科技有限公司进行合成，并进行密码子优化，以利于其在B.subtilis168的异源表达。

以公司提供的pET28a-pls重组质粒为模板，以pls-F:aaaaggagcgatttacatatgatgagtagtccgctgctggaga和pls-R:gagctcgactctagaggatccttatgctgctgcgccaccctcg为引物进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增，获得含同源臂的pls基因片段。

1.2.2 重组菌株的构建

将胶回收纯化的pls基因片段与经NdeI、BamH I限制性快切酶酶切且胶回收获得的pMA5线性化质粒在37 ℃下同源重组连接30 min，获得的连接产物转化E.coliJM109感受态细胞，涂布至含质量浓度50 μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，于37 ℃培养箱倒置培养8～12 h。挑取转化子进行培养，提取重组质粒进行双酶切验证，验证正确的质粒送苏州金唯智有限公司进行测序分析，SnapGene 2.3.2软件分析测序结果，测序正确的重组质粒命名为pMA5-pls。

将重组质粒pMA5-pls转化B.subtilis168感受态细胞，涂布至含质量浓度50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，于37 ℃培养箱倒置培养8～12 h。挑取转化子进行菌落PCR验证，验证正确的重组菌株命名为B.subtilis168/pMA5-pls。

1.2.3 ε-聚赖氨酸合酶的表达

首先，将冻干管保存的B.subtilis168/pMA5-pls重组菌株在含质量浓度50 μg/mL卡那霉素的LB平板上划线活化，挑取单菌落转接10 mL的LB液体培养基(含50 μg/mL卡那霉素)，37 ℃、200 r/min下培养8～12 h后，按10%接种量转接50 mL的M3G发酵培养基(含质量浓度50 μg/mL卡那霉素)，30 ℃、180 r/min下培养72 h，以诱导ε-聚赖氨酸合酶的表达。之后，在4 ℃、10 000 r/min下离心10 min收集细胞，弃去培养基，细胞菌体用10 mL缓冲液A清洗悬浮后，4 ℃、10 000 r/min下离心20 min，弃去上清液。再换用等量缓冲液B清洗悬浮，4 ℃、8 000 r/min下离心5 min，弃去上清液。最后，将细胞菌体悬浮于5 mL缓冲液C中并用超声破碎仪进行破碎，破碎液在4 ℃下离心20 min，收集上清，用于后续的酶活测定，蛋白浓度测定采用Bradford法[18-19]。对照菌株B.subtilis168按照同样的方法进行诱导表达。

1.2.4 酶活测定

ε-聚赖氨酸合酶的酶活测定体系[20-22]：100 nmol/L、pH 8.5的TAPS-NaOH，990 mmol/LL-赖氨酸，5 mmol/L MgCl2，5 mmol/L ATP，1 mmol/L DTT，20%甘油(体积分数)，2 g/L NP-40和占总体积10%的酶溶液。

首先，将不含粗酶液的反应混合物在30 ℃下孵育10 min，然后加入反应总体系10%的粗酶液启动酶反应，反应10 min后，在酶反应体系中加入质量浓度150 g/L三氯乙酸溶液以终止反应。

配置不同质量浓度的ε-聚赖氨酸标准溶液(25～200 mg/L)，各取1 mL不同浓度的ε-聚赖氨酸标准溶液加入到2.8 mL磷酸盐缓冲液(0.1 mmol/L、pH 7.0)中，再添加120 μL台盼蓝溶液(1 mg/mL)，充分混合并在37 ℃下孵育60 min，测定A580[23]，绘制标准曲线。按照同样的操作方法，将1 mL转化液加入到2.8 mL 磷酸盐缓冲液(0.1 mmol/L、pH 7.0)中，并添加120 μL台盼蓝溶液(1 mg/mL)，充分混合并在37 ℃下孵育60 min，测定A580。酶活定义为1 min生成1 μmol的ε-聚赖氨酸所需的酶量为1 U。ε-聚赖氨酸含量的计算则通过将测得的A580代入标准曲线方程来确定。

1.2.5 ε-聚赖氨酸的MALDI-TOF-MS质谱分析

将转化液进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)分析，以确定转化液中是否生成ε-聚赖氨酸，并将所得数据利用MassLynx 4.1 SCN 562/SCN 568软件计算ε-聚赖氨酸的分子质量[24-26]，并判断产物ε-聚赖氨酸的聚合状态。

1.2.6 全细胞催化生产ε-聚赖氨酸

将冻干管保存的B.subtilis168/pMA5-pls重组菌株首先在含质量浓度50 μg/mL卡那霉素的LB平板上划线活化，挑取单菌落转接10 mL的LB液体培养基(含50 μg/mL卡那霉素)，37 ℃、200 r/min下培养8～12 h后，转接250 mL的M3G发酵培养基(含质量浓度50 μg/mL卡那霉素)，30 ℃、180 r/min下培养72 h，4 ℃、10 000 r/min下离心10 min以收集菌体细胞。取25 mg的L-赖氨酸投加至50 mL缓冲液C中使转化体系中L-赖氨酸终质量浓度为0.5 g/L，然后再在转化体系中投加5 g细胞菌体并充分混合，最后，于30 ℃、200 r/min下连续转化4 h，测定转化液中ε-聚赖氨酸的含量。

1.2.7 抗菌活性检测

将大肠杆菌(E.coliJM109)和新生分枝杆菌(MycobacteriumneoaurumVKM Ac-1815D)分别接种到LB和BHI培养基中，分别置于37 ℃和30 ℃下培养12 h。将取适量获得的菌液分别涂布于LB和BHI固体平板，并在平板中间加入含有200 μL的重组菌株B.subtilis168/pMA5-pls转化液，最后，分别置于37 ℃培养24 h和30 ℃培养48 h，观察有无明显抑菌圈。

2 结果与分析

2.1 B. subtilis 168/pMA5-pls重组菌株的构建

根据文献报道，白色链霉菌来源的基因GC偏高，这可能不利于其在其他宿主细胞中进行异源表达[27]。于是，我们对NCBI数据库查询到的白色链霉菌S.albulus来源的ε-聚赖氨酸合酶编码基因pls(GenBank: AB385841.1)的GC含量进行分析，结果表明其GC含量高达75%。因此，在pls基因合成过程中，对其密码子进行了优化，使其GC含量降低为58.21%，以期能够成功实现在B.subtilis168中的异源表达。

如图1所示，以pls-F和pls-R为引物，以pET28a-pls质粒为模板PCR扩增获得的pls基因片段，回收后的pls基因片段与pMA5线性化质粒进行同源重组连接，连接产物转化E.coliJM109。重组质粒进行双酶切验证，验证成功的送苏州金唯智有限公司进行测序分析，SnapGene 2.3.2软件分析测序结果，测序正确的菌株命名为E.coliJM109/pMA5-pls。重组质粒pMA5-pls转化B.subtilis168感受态细胞，转化子菌落PCR验证正确的重组菌株命名为B.subtilis168/pMA5-pls。

M，10 000 bp核酸Marker；A中泳道1～2，pMA5-pls重组质粒双酶切验证结果；B中泳道1～6，重组菌株B. subtilis168/pMA5-pls转化子菌落PCR验证结果A-双酶切验证；B-菌落PCR验证

2.2 ε-聚赖氨酸合酶的表达与酶活测定

将B.subtilis168对照菌株与B.subtilis168/pMA5-pls重组菌株按照1.2.3所述的方法进行ε-聚赖氨酸合酶的诱导表达，细胞破碎离心收集的粗酶液进行酶活测定，酶活测定结果显示，B.subtilis168对照菌株中未检测到ε-聚赖氨酸合酶酶活，而B.subtilis168/pMA5-pls重组菌株中检测到ε-聚赖氨酸合酶酶活，通过计算得出，ε-聚赖氨酸合酶的比酶活为71 U/mg，即ε-聚赖氨酸合酶在B.subtilis168中成功实现了功能性表达。

2.3 ε-聚赖氨酸的MALDI-TOF-MS分析

ε-聚赖氨酸的抑菌谱很广，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及一些病毒都有较好的抑菌效果，而ε-聚赖氨酸的抑菌活性与L-赖氨酸的聚合度有关。当L-赖氨酸的聚合度低于9时，ε-聚赖氨酸几乎没有抑菌活性，只有当L-赖氨酸的聚合度高于9时，特别是聚合度为25～35，ε-聚赖氨酸具有较强的抑菌活性[2, 28]。

为了鉴定酶反应产物是否为目的产物ε-聚赖氨酸，并确定ε-聚赖氨酸的聚合状态和相对分子质量。采用MALDI-TOF-MS对酶反应产物进行了分析。结果如图2所示，B.subtilis168/pMA5-pls重组菌株转化L-赖氨酸生成的ε-聚赖氨酸的相对分子质量分布在3 605～4 502 Da，且主要集中于4 118 Da。根据赖氨酸的分子质量，可知其对应聚合度为25～30，主要为28，进一步验证了ε-聚赖氨酸合酶在B.subtilis168中成功实现了功能性表达。

A-ε-聚赖氨酸标准样品;B-转化液样品

2.4 B. subtilis 168/pMA5-pls重组菌株全细胞催化生产ε-聚赖氨酸的条件优化

2.4.1 温度对ε-聚赖氨酸生产的影响

温度主要通过影响酶活性进而影响产物的生成。通过将5 g的B.subtilis168/pMA5-pls重组菌株的菌体投入到添加质量浓度0.5 g/L底物L-赖氨酸的50 mL缓冲液C中，分别置于20、25、30、35、40、45和50 ℃，200 r/min下转化4 h，检测ε-聚赖氨酸含量，以确定最优转化温度。如图3所示，在20～30 ℃，ε-聚赖氨酸含量随着温度的升高而升高，最优温度为30 ℃，ε-聚赖氨酸质量浓度达到181.6 mg/L；但当温度超过30 ℃时，温度越高，ε-聚赖氨酸含量不断下降，特别是温度为45 ℃时，ε-聚赖氨酸含量较35 ℃时的ε-聚赖氨酸下降了56.9%。由此可知，B.subtilis168/pMA5-pls重组菌株全细胞催化生产ε-聚赖氨酸的最优温度为30 ℃。

图3 温度对ε-聚赖氨酸生产的影响

2.4.2 初始pH对ε-聚赖氨酸生产的影响

将5 g的B.subtilis168/pMA5-pls重组菌株的菌体投入到添加质量浓度0.5 g/L底物L-赖氨酸的不同pH的50 mL缓冲液C中，pH分别设为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0，于30 ℃、200 r/min下反应4 h，检测不同pH条件下ε-聚赖氨酸的含量。由图4结果分析可知，pH为3.0时，ε-聚赖氨酸的含量最高，为185.9 mg/L。当pH高于3.0时，ε-聚赖氨酸的含量不断下降，pH为7.0时，ε-聚赖氨酸的含量仅为109.4 mg/L。由此可知，B.subtilis168/pMA5-pls重组菌株全细胞催化生产ε-聚赖氨酸的最优pH为3.0。

图4 初始pH对ε-聚赖氨酸生产的影响

2.4.3 底物浓度对ε-聚赖氨酸生产的影响

首先在pH 3.0的缓冲液C中投加不同质量浓度的L-赖氨酸(0.1～1.0 g/L，质量浓度间隔为0.1 g/L)，之后分别投加5 g的B.subtilis168/pMA5-pls重组菌株的菌体，于30 ℃、200 r/min下反应4 h，检测不同L-赖氨酸质量浓度下ε-聚赖氨酸的含量。由图5可知，L-赖氨酸质量浓度在0.1～0.5 g/L时，随着质量浓度的升高，ε-聚赖氨酸的含量上升缓慢，但当L-赖氨酸质量浓度上升至0.5 g/L时，ε-聚赖氨酸的含量上升迅速，达到195.1 mg/L。而L-赖氨酸质量浓度继续提高时，ε-聚赖氨酸的含量却不断降低。由此可知，B.subtilis168/pMA5-pls重组菌株全细胞催化生产ε-聚赖氨酸的最优底物质量浓度为0.5 g/L。

图5 不同L-赖氨酸质量浓度对ε-聚赖氨酸生产的影响

2.5 ε-聚赖氨酸的抗菌活性检测

为了验证B.subtilis168/pMA5-pls重组菌株全细胞催化L-赖氨酸产生的ε-聚赖氨酸是否具有抗菌活性。本研究以大肠杆菌E.coli和分枝杆菌M.neoaurumVKM Ac-1815D为研究对象，测试了反应产物对大肠杆菌E.coli和分枝杆菌M.neoaurumVKM Ac-1815D的生长是否有影响。测试结果如图6所示，E.coli形成的抑菌圈直径约为13 mm，M.neoaurumVKM Ac-1815D形成的抑菌圈直径约为12 mm。结果表明，全细胞催化生成的ε-聚赖氨酸能够抑制E.coliJM109和M.neoaurumVKM Ac-1815D的生长，进一步证实了ε-聚赖氨酸合酶成功实现了在B.subtilis168中的功能性表达，利用B.subtilis168/pMA5-pls重组菌株全细胞催化L-赖氨酸产生的ε-聚赖氨酸具有良好的抑菌效果。

A-ε-聚赖氨酸对E. coli JM109的抑菌效果;B-ε-聚赖氨酸对M.neoaurum VKM Ac-1815D的抑菌效果

3 讨论

ε-聚赖氨酸是一种由25～35个L-赖氨酸通过异形肽键连接而成的较为特殊的阳离子氨基酸聚合物，由于其具备易降解、可食用、对人体和环境无毒无害等特性而广泛应用于食品和医药行业[3-5]。尽管目前通过对白色链霉菌菌种选育结合发酵条件优化策略，ε-聚赖氨酸产量已达到较高水平，但是，非GRAS菌株产生的ε-聚赖氨酸的安全性问题却令人堪忧，这可能会限制其在食品和医药行业的应用[13-14]。SHIMA等曾通过14C放射性同位素标记技术对L-赖氨酸进行标记，证实了L-赖氨酸是ε-聚赖氨酸生产的前体物质[29]。然而，目前未有将ε-聚赖氨酸合酶异源表达，利用全细胞催化实现ε-聚赖氨酸生产的相关研究、本文首次实现了ε-聚赖氨酸合酶在GRAS菌株B.subtilis168中的异源表达，并将其作为细胞工厂，全细胞催化实现了ε-聚赖氨酸的生物合成。

虽然本研究获得的ε-聚赖氨酸的含量未达到较高水平，但是却为食品级ε-聚赖氨酸的生产提供了一种新策略。下一步，将会针对ε-聚赖氨酸合酶进行理性改造，提高其催化活性，以进一步改善ε-聚赖氨酸产量。