响应面法优化超声提取芝麻粕中多酚工艺及其抗氧化活性研究

张海容，陈金娥，高瑞苑

(忻州师范学院 生化分析技术研究所，山西 忻州 034000

芝麻是我国重要的优质油料和特色农作物，种植面积十分广泛，主要分布在河南、湖北、安徽、山东等省，约占世界芝麻总产量的34%，因其含油量高而素有油料作物“皇后”之美誉，具有极高的营养价值[1]。芝麻中以脂肪和蛋白质为主，还含有机酸类、黄酮类、多酚类、木脂素类、维生素及人体必需氨基酸[2-4]、微量元素[5]等营养成分。迄今为止，我国80%以上的芝麻用来榨取芝麻油，芝麻饼粕的年产量超过50万t。而脱脂后的芝麻粕主要作为饲料或肥料使用，深加工和综合利用的研究尤显不足，造成巨大的资源浪费。因此，深入研究开发芝麻粕中对人类有益活性成分非常重要，进而达到最大化利用资源的目的。

目前，对芝麻粕中蛋白质[6-8]、木脂素类[9-10]及其抗氧化活性研究较多，而芝麻粕中多酚及其抗氧化活性的研究鲜有报道[4]。植物多酚又名植物单宁，主要存在于植物的皮、根、叶、果中，在植物中的含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素，具有抗氧化、抗衰老、调节免疫、抗炎镇痛、抗癌抗肿瘤、抗心脑血管疾病和抑菌抗病毒等作用[11]。超声波法是一种现代分离技术[12-16]，利用超声波的空化作用、机械作用以及热效应，可加速细胞壁的破碎，促进胞内有效成分的溶出。因超声波法提取效率高，已经成为提取植物活性成分研究领域的热点技术。因此，本文选用芝麻粕为试验对象，研究超声辅助乙醇提取芝麻粕中多酚类化合物，采用Box-Behnken设计响应面法对所选试验参数进行分析和优化，确定芝麻粕中多酚的最佳提取工艺条件；并通过对DPPH·清除作用进行抗氧化活性[17]分析与评价，为芝麻粕的深度开发和综合利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

芝麻粕，取自山西省神池粮油食品加工厂；没食子酸丙酯标准品(国药集团化学试剂有限公司)，实验用重蒸水溶解制得1 000 μg/mL储备液；FeSO4·7H2O、C4H4O6NaK·4H2O、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、无水乙醇、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)，均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

UV-1800紫外可见分光光度计，日本岛津公司；AB204-N型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器；AL204-N旋转蒸发仪；501A型超级数显恒温水浴；SHZ-D(Ⅲ)型循环水真空泵。

1.2 试验方法

1.2.1 芝麻粕中多酚的提取

将芝麻粕于100℃真空干燥箱中干燥10 h，粉碎过40目筛，保存备用。准确称取芝麻粕粉1.000 g于锥形瓶中，加入提取溶剂，设定不同超声功率、超声时间、液料比和超声温度提取芝麻粕2次，合并提取液，离心10 min除杂，用重蒸水定容于100 mL容量瓶中，保存待测。以多酚产率为指标，采用单因素试验考察不同提取溶剂、超声功率、超声时间、超声温度以及液料比对多酚产率的影响。在此基础上，采用响应面试验进行工艺优化。

1.2.2 多酚含量的测定

采用酒石酸亚铁比色法测定。酒石酸亚铁显色剂的配制：准确称取1.00 g硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)和5.00 g酒石酸钾钠(C4H4O6NaK·4H2O)，用重蒸水溶解混合定容于1 000 mL容量瓶中。pH为7.4磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的配制：准确称取6.02 g含有12个结晶水的磷酸氢二钠、0.50 g含有2个结晶水磷酸二氢钠，用重蒸水溶解混合定容于100 mL容量瓶中。

没食子酸丙酯标准曲线的绘制：准确吸取没食子酸丙酯储备液0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 mL分别置于10 mL比色管中，再各加入5 mL显色剂，用缓冲液定容至刻度。以试剂空白作参比，在540 nm波长处测定吸光度，得吸光度(A)与没食子酸丙酯质量浓度(C)的标准回归方程：A=0.012 4C-0.016 1，R2=0.999 3。

芝麻粕提取液多酚含量的测定：准确吸取2 mL提取液至10 mL的比色管中，然后加入5 mL显色剂，用缓冲液定容至刻度。以试剂空白作参比，在540 nm波长处测定吸光度，代入回归方程计算多酚产率，计算公式如下：

式中：C为芝麻粕提取液测得多酚质量浓度，μg/mL；γ为稀释倍数；V为芝麻粕提取液体积， mL；m为芝麻粕干粉质量，g；106为换算系数。

1.2.3 多酚抗氧化活性(DPPH法)测定

取不同体积芝麻粕多酚提取液及2 mL2×10-4mol/L的DPPH溶液加入10 mL比色管中，摇匀，30 min后用提取液作参比，在517 nm处测定吸光度，同时用蒸馏水作参比，测定2 mL 2×10-4mol/L DPPH 溶液的吸光度，根据下式计算自由基清除率：

式中：A参比为加入蒸馏水时的吸光度；A对照为加入DPPH溶液的体系的吸光度；A样参为加入不同提取液后的吸光度；A样品为加入不同提取液+DPPH溶液后体系的吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 不同提取溶剂对多酚产率的影响

多酚是植物体内一类与蛋白质、糖类物质等以氢键结合的分子复合物，而多酚物质大多相对分子质量大、羟基数量多，所以提取溶剂不仅需对多酚具有良好的溶解性，而且与多酚更易结合形成氢键，才能最大程度地将植物中的多酚溶出。选择水、甲醇、不同体积分数乙醇溶液、乙酸乙酯、丙酮、氯仿和环己烷等有机溶剂，在超声功率320 W、超声时间30 min、液料比50∶1、超声温度50℃条件下进行试验，提取溶剂对多酚产率的影响见图1。

注：1.水；2.甲醇；3.乙醇；4.20%乙醇；5.40%乙醇；6.60%乙醇；7.80%乙醇；8.环己烷；9.乙酸；10.乙酸乙酯；11.丙酮；12.氯仿。

图1不同提取溶剂对多酚产率的影响

试验表明，在超声电磁强化[18]作用下，多酚在水、甲醇、乙醇/水混合极性溶剂体系中有较好的溶解性；乙酸、乙酸乙酯、丙酮次之，几乎不溶于氯仿、环己烷。多酚物质一般极性较强，因此易溶于水。试验发现，对于以缩合单宁为主体的芝麻多酚，体积分数为20%～80%乙醇溶液最适合多酚物质的提取。由图1可知，随着乙醇体积分数的增加，多酚产率增大，当乙醇体积分数达80%时，多酚产率有所下降，这可能是因为乙醇体积分数过高使一些脂溶性物质,如叶绿素等[19]的溶出量也增大，不利于多酚的溶出。故本研究选取体积分数为60%乙醇溶液提取芝麻粕中多酚。

2.1.2 超声时间对多酚产率的影响

固定乙醇体积分数60%、超声功率240 W、超声温度50℃、液料比40∶1，在超声时间分别为10、20、30、40、50 min下进行试验，超声时间对多酚产率的影响如图2所示。

由图2可知，随着超声时间的延长，多酚产率呈现先增加后降低的趋势，当超声时间为30 min时，多酚产率最大。综合考虑提取成本与效率，选择超声时间为30 min。

图2 超声时间对多酚产率的影响

2.1.3 液料比对多酚产率的影响

固定乙醇体积分数60%、超声功率240 W、超声时间30 min、超声温度50℃，在液料比分别为20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1下进行试验，液料比对多酚产率的影响如图3所示。

图3 液料比对多酚产率的影响

由图3可知，当液料比小于50∶1时，随着液料比的增加，多酚产率增大，这是因为增加液料比，传质动力增加，多酚就更容易溶出；当液料比大于50∶1时，多酚溶出速率略有所降低。因此，考虑成本与效益，选取液料比为50∶1。

2.1.4 超声温度对多酚产率的影响

固定乙醇体积分数60%、超声功率240 W、超声时间30 min、液料比40∶1，在超声温度分别为30、40、50、60、70℃下进行试验，超声温度对多酚产率的影响如图4所示。

图4 超声温度对多酚产率的影响

由图4可知，超声温度对多酚产率的影响呈先上升后下降的趋势，超声温度在30～50℃时，多酚产率随超声温度升高而增加，其原因是随温度升高，分子运动加快，导致渗透、扩散、溶解速度加快，化合物更易从细胞转移到溶剂中；由于植物多酚稳定性对温度变化较敏感[20]，当超声温度高于50℃时，导致多酚结构发生变化，多酚产率下降。因此，选择超声温度为50℃。

2.1.5 超声功率对多酚产率的影响

固定乙醇体积分数60%、超声时间30 min、液料比40∶1、超声温度50℃，在超声功率分别为160、240、320、400 W下进行试验，超声功率对多酚产率的影响如图5所示。

图5 超声功率对多酚产率的影响

由图5可知，当超声功率小于320 W时，随着超声功率的增大，多酚产率增大，这是因为超声功率增强，介质质点运动加速，使有效物质迅速溶出，但超声功率超过320 W时，多酚产率不再增加。综合分析，选择超声功率为320 W时较为理想。

2.2 响应面法优化芝麻粕中多酚提取工艺

在单因素试验的基础上，综合考虑各因素对芝麻粕多酚产率的影响，固定乙醇体积分数为60%，选取对多酚产率相对影响较大的超声功率(A)、超声温度(B)、液料比(C)和超声时间(D)为因素，以多酚产率(Y)为响应值，按中心组合试验设计原理，设计四因素三水平的响应面优化试验，试验因素水平及编码见表1，响应面试验设计及结果见表2。

表1 试验因素水平及编码

利用Design-Expert V8.0.6软件对表2试验数据进行方差分析和多元回归拟合。拟合的多元回归方程为：Y=2.91-0.25A+0.12B+0.09C-0.053D+0.1AB+0.083AC+0.25AD+0.74BC-0.045BD-0.21CD+0.12A2-0.31B2-0.37C2-0.19D2。回归模型方差分析见表3。

表2 响应面试验设计及结果

表3 回归模型方差分析

注：P<0.01，影响极显著；P<0.05，影响显著。

对回归方程中4个因素分别求偏导，并令一阶导数等式为零，解方程可得到4个因素的最佳水平值，分别为：A=0.953 8,B=0.481 8,C=0.697 5,D=0.045 5，转换后得到提取的最佳条件为：超声功率316 W，超声温度54℃，液料比57∶1，超声时间30 min。通过回归方程计算，多酚产率最大理论值为2.95%。

2.3 芝麻粕中多酚提取优化工艺验证

考虑到生产成本及仪器的可操作性，将优化工艺条件校正为：超声功率320 W，超声温度54℃，液料比57∶1，超声时间30 min。在修正后优化条件下进行验证性试验(n=3)，多酚产率平均值为2.86%，与理论预测值相对误差为3.05%。用Box-Behnken设计响应面法得到的试验模型对提取芝麻粕中多酚工艺条件稳定可靠。

2.4 芝麻粕多酚提取液对DPPH·的清除作用

DPPH具有较活泼的化学性质，极易形成自由基。在反应体系中对DPPH·的清除率越高，表明物质的抗氧化能力越强[17]。试验选择质量浓度相近的食品抗氧化剂叔丁基对苯二酚(TBHQ；CTBHQ=66.00 μg/mL)与芝麻粕多酚提取液(C=65.87 μg/mL)作对比，结果如图6所示。

图6 芝麻粕多酚提取液对DPPH·的清除作用

由图6可知，芝麻粕多酚提取液及TBHQ对DPPH·的清除率随着加入量增加而增大，分别加入相同质量浓度的芝麻粕多酚提取液和TBHQ，芝麻粕多酚提取液抗氧化能力明显优于TBHQ。这是因为芝麻粕多酚是一个复杂成分体系[1-5]，其中包括单宁、低相对分子质量的酚、黄酮类化合物，甚至糖类和色素。由图6也可知，当DPPH·清除率为50%时，芝麻粕多酚提取液IC50为34.91 μg/mL，TBHQ的IC50为92.40 μg/mL。因此，芝麻粕多酚具有较强抗氧化活性。

3 结 论

(1)在单因素试验的基础上，以多酚产率为指标，选取超声功率、超声温度、液料比及超声时间4个因素进行中心组合设计，建立了超声提取芝麻粕中多酚工艺的数学模型：Y=2.91-0.25A+0.12B+0.09C-0.053D+0.1AB+0.083AC+0.25AD+0.74BC-0.045BD-0.21CD+0.12A2-0.31B2-0.37C2-0.19D2。该模型的稳定性较好。通过模型显著性检验，得到因素的主效应关系为：超声功率>超声温度>液料比>超声时间。最佳的工艺条件为以60%乙醇溶液为提取溶剂、超声功率320 W、超声温度54℃、液料比57∶1、超声时间30 min,在此条件下进行验证性试验，多酚产率为2.86%，与理论产率相近。

(2)对比研究了芝麻粕多酚提取液与TBHQ抗氧化能力，芝麻粕多酚提取液清除DPPH·IC50为34.91 μg/mL，TBHQ的IC50为92.40 μg/mL，芝麻粕多酚有较强清除自由基作用，芝麻粕虽然是提取油料的副产物，有望作为天然抗氧化剂和功能性食品而得到开发利用。