肺气虚寒型变应性鼻炎患者Thl7/Treg细胞中转录因子表达的差异性研究*

张丽娟 庞志宇 李得堂 周小军 黄育生 刘媛

变应性鼻炎（allergic rhinitis,AR）是特应性个体接触变应原后，由免疫球蛋白E（IgE）介导的鼻黏膜非感染性炎症性疾病[1]。AR的发病机制目前尚未完全明确，其发生发展是一个复杂的过程，已经成为国内外研究的热点和难点[2-8]，通过对AR发病机制更深入的研究，发现其机制已经由Th1/Th2失衡模式扩展到 Th17/Treg 细胞免疫失衡模式[4，9，10]。Th17细胞是一种独特的Th细胞亚群，转录因子维甲酸相关孤核受体-γt（Retinoid-related orphan nuclear receptor γt，ROR-γt）是其调节免疫平衡中关键的调控基因，调节Th17/Treg之间的平衡[11]。调节性T细胞（Treg）是一群维持体内稳态的CD4 T细胞亚群，对体内免疫反应起到抑制的作用。叉状头/翅膀状螺旋转录因子 (Transcription factor Forkhead box P3，Foxp3)是Treg细胞发育、分化及发挥功能的关键特征性的转录因子，对Treg细胞的免疫抑制活性具有至关重要的作用[12]。ARIA指南根据患者症状的持续时间和严重程度，将AR分为4种临床类型：轻度间歇性、中-重度间歇性、轻度持续性、中-重度持续性[13，14]。AR属于中医学中的“鼻鼽”范畴，有多种证型，其中肺气虚寒型较为常见。本文通过检测不同分类与分度的肺气虚寒型AR患者外周血中转录因子ROR-γt、Foxp3 、ROR-γt/Foxp3的表达，为深入研究肺气虚寒型AR的Th17/Treg细胞免疫失衡机制提供临床基础的实验依据。

材料与方法

1 材料

1.1实验仪器试剂

7500Real-time PCRSystem（美国 ABI公司），GeneAmp*PCR System 9700（美国 ABI公司），Trizol Reagent（美国 Invitrogen公司），Bio-Rad Smart-SpecTM Plus Spectrophotometer（美国 Bio-Rad公司），蛋白电泳仪（美国Bio-Rad公司），凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2试剂

SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)（Takara公司），Takara Mimi BRST universal RNA Extraction Kit（Takara公司）,PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)（Takara公司）。

2 方法

2.1肺气虚寒型AR病例的收集及分类与分度

选取我院门诊、住院患者确诊但未经治疗的肺气虚寒型AR患者19例：男8例，女11例，平均年龄29.7岁，年龄范围为（24～49）岁；对照组为健康志愿者10例：男5例、女5例，平均年龄34.3岁，年龄范围为（22～53）岁，入选对照组者均无过敏性疾病的病史，所有患者及健康对照者均签署知情同意书。

19例的肺气虚寒型AR患者，均依据《中医病症诊断疗效标准》[15]，符合鼻鼽症状。对收入的肺气虚寒型AR病例依据“变应性鼻炎诊断和治疗指南(2015年，天津)[1]”，并参考美国耳鼻咽喉头颈外科学会推荐的变应性鼻炎临床实践指南，进行分类及分度[13，14]，完成鼻症状总分（TNSS）评分、鼻伴随症状总分（TNNSS）评分、生命质量调查问卷（RQLQ）积分评分和视觉模拟量表（VAS）评分。根据患者症状发生的频率及持续的时间进行分类：分为持续性AR和间歇性AR。持续性：症状≥4d/周，且≥连续4周；间歇性：症状＜4d/周，或＜连续4周。根据患者症状的严重程度，以及是否影响患者生活质量(包括睡眠、日常工作、生活和学习)进行分度：分为中-重度AR和轻度AR。中-重度：症状明显或严重，对生活质量产生影响；轻度：症状较轻，症状存在时对生活质量尚未产生影响。19例肺气虚寒型AR患者分类及分度：轻度间歇性 AR（Mild intermittent AR，MI AR）4例；轻度持续性AR（Mild persistent AR，MP AR）4例；中-重度间歇性 AR（Moderate to severe intermittent AR，MSI AR）8例；中-重度持续性AR（Moderate to severe persistent AR，MSP AR）3例。

2.2外周血检测标本的采集

对纳入标准的肺气虚寒型AR组及对照组，清晨空腹采集外周静脉血2ml，置于肝素纳抗凝的取血管中，液氮保存，备用。

2.3RT-qPCR检测ROR-γt mRNA和Foxp3 mRNA表达

2.3.1总RNA提取和鉴定

取备用的样品，每个孔加入Trizol试剂1ml，按Trizol试剂说明书进行。室温，反复吹打，裂解5min。裂解产物转到新EP管中，在25℃下，静置5min，加入三氯甲烷 200μl，震荡 15s，在 25℃下，静置 5min。在4℃下，12000rpm离心5min，液体分为3层，无色液体层转移到新的EP管中。加入异丙醇500μl，上下颠倒，混匀，在25℃下，静置10min。在4℃下，12000rpm离心15min，弃上清，白色沉淀中加入75%的无水乙醇溶液1ml，洗涤沉淀。10000rpm离心5min，弃无水乙醇液，干燥5min后。加入30μl DEPC处理过的去离子水，使沉淀溶解。取纯化后的RNA1μL，紫外分光光度计进行检测纯度，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。

2.3.2cDNA合成

依据逆转录试剂盒说明书，37℃15min，85℃15s，4℃逆转录，琼脂糖凝胶电泳检测逆转录结果。

2.3.3引物设计与合成

检索 NCBI Genebank里的基因序列，Prime premier 5.0软件设计引物序列合成，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，见表1。

表1 RT-qPCR检测ROR-γt和Foxp3因子设计的引物

2.3.4RT-qPCR的检测

每个样品均进行 ROR-γt、Foxp3和内参 βactin的RT-qPCR，每个样品设两个平行管。总反应体积 20μl，反应条件:95℃30s；95℃15s，60℃ 1min,共40 个循环；95℃15s，60℃ 1min，95℃ 15s，60℃ 15s结束反应。计算ROR-γt mRNA、Foxp3 mRNA及βactin mRNA Ct值的平均值；根据目标基因和βactin Ct值均值计算样本目标基因实际Ct值ΔCt=Ct目标-Ctβ-actin，对各样本 ΔCt进行 2-ΔΔCt转换，分析目标基因mRNA的表达，其中ΔΔCt=ΔCt实验-ΔCt对照（对照为健康对照者）。

3 统计学方法

用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。经正态检验，符合正态分布者均以±s表示，组间差异比较采用方差分析进行统计分析，方差齐采用LSD法进行两两组间比较，不符合正态分布者采用秩和检验。

结果

1 RT-qPCR检测的扩增曲线及扩增效率

提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见较清晰的条带，表明总RNA降解较少，且无DNA污染。计算得ROR-γt、Foxp3和β-actin基因的扩增效率分别为96%、98%和95%，扩增效率接近于100%，扩增效率达到最佳，因此所用比较Ct的2-ΔΔCt法计算的基因相对表达量结果更接近于真实值，ROR-γt(A)、Foxp3(B)和 β-actin(C)基因各组的扩增曲线，见图1。

图 1 ROR-γt(A)、Foxp3(B)和 β-actin(C)基因的扩增曲线

2 PCR产物分析

ROR-γt、Foxp3和 β-actin基因 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳证实PCR产物为单一目的条带，扩增产物大小分别为192bp、144 bp及259 bp。ROR-γt、Foxp3和β-actin基因的熔解曲线分析显示，为单一锐利主峰型，无杂峰，ROR-γt、Foxp3 和 β-actin基因PCR产物的熔解曲线的峰值分别为88.4℃、87.3℃及88.4℃，熔解温度均一，说明无引物二聚体及非特异性扩增，Tm值为60℃，扩增产物特异性好，ROR-γt(A)、Foxp3(B)和 β-actin(C)基因各组的溶解曲线，见图2。

图 2 ROR-γt(A)、Foxp3(B)和 β-actin(C)基因的溶解曲线

3 肺气虚寒型 AR患者 ROR-γt、Foxp3及ROR-γt/Foxp3 mRNA的相对表达量

结果表明，在19例肺气虚寒型AR患者外周血中，ROR-γt mRNA 表达明显高于对照组（*P＜0.05），而Foxp3 mRNA表达显著低于对照组（**P＜0.01）。ROR-γt/Foxp3 mRNA水平显著高于对照组（**P＜0.01），差异具有显著的统计学意义，见图3。

图3 对照组与肺气虚寒型AR患者组ROR-γt（A）、Foxp3（B）及ROR-γt/Foxp3（C）mRNA相对表达的比较。**P＜0.01，*P＜0.05

4 不同分类与分度的肺气虚寒型AR患者ROR-γt、Foxp3及ROR-γt/Foxp3 mRNA的相对表达量

结果表明，在不同分类与分度的肺气虚寒型AR患者外周血中，中-重度持续性AR组ROR-γt mRNA、ROR-γt/Foxp3 mRNA表达显著高于对照组（**P＜0.01），而Foxp3 mRNA表达明显低于对照组（*P＜0.05）。中-重度持续性AR组ROR-γt mRNA表达显著高于轻度间歇性、中-重度间歇性及轻度持续性（**P＜0.01）。中-重度持续性 AR组 Foxp3 mRNA表达显著低于轻度间歇性（**P＜0.01）。中-重度持续性AR组ROR-γt/Foxp3 mRNA表达显著高于轻度间歇性、中-重度间歇性及轻度持续性（**P＜0.01），见表 2、图 4。

表2 对照组与不同分类与分度的肺气虚寒型AR患者组ROR-γt、Foxp3 及 ROR-γt/Foxp3 mRNA的相对表达量±s)

表2 对照组与不同分类与分度的肺气虚寒型AR患者组ROR-γt、Foxp3 及 ROR-γt/Foxp3 mRNA的相对表达量±s)

注：ROR-γtmRNA相对表达量，与对照组比较，**P＜0.01；Foxp3 mRNA相对表达量，与对照组比较，*P＜0.05；ROR-γt/Foxp3 mRNA相对表达量，与对照组比较，**P＜0.01；不同分类与分度的肺气虚寒型AR患者组之间比较，△△P＜0.01

组别 例数（n） ROR-γt Foxp3ROR-γt/Foxp3对照组（Control） 10 0.594±0.103 0.904±0.135 0.554±0.181轻度间歇性AR 4 0.561±0.241△△ 1.056±0.206△△ 0.531±0.345△△中 - 重度间歇性 AR 8 0.630±0.136△△ 0.932±0.1560.676±0.267△△轻度持续性 AR 4 0.708±0.192△△ 0.844±0.097 0.839±0.328△△中-重度持续性AR 3 1.355±0.112**△△ 0.540±0.085*△△ 2.569±0.618**△△

图4 对照组与不同分类与分度的肺气虚寒型AR患者组ROR-γt（A）、Foxp3（B）及ROR-γt/Foxp3（C）mRNA相对表达的比较。**P＜0.01，*P＜0.05

讨论

目前AR的发病机制尚未完全明确，其发生发展是一个复杂的过程[2-8]，西医学对发病机制研究较为成熟的是经典的Th1/Th2细胞免疫失衡学说。正常状态下Th1和Th2细胞通过所分泌的细胞因子共同调节机体的免疫应答过程，二者相互制约，相互调节，保持动态平衡状态。当机体受到变应原及相关刺激因素，Th1/Th2细胞免疫平衡被打破，Th1细胞中分泌的因子表达降低，Th2细胞中分泌的因子表达升高，导致Th1/Th2细胞中因子比值降低，出现失衡状态，引发异常的免疫应答。但是随着研究的进一步深入，其机制已经由Th1/Th2失衡模式扩展到Th17/Treg失衡模式，形成Th1/Th2/Th17/Treg细胞的免疫失衡。

Treg细胞作为重要的免疫抑制细胞，可作用于多种免疫细胞，抑制其功能，对体内免疫反应起抑制作用，已确知Treg细胞可以抑制Th1细胞和Th2细胞的免疫活性，可通过细胞-细胞接触依赖的抑制模式抑制Th细胞的分化调节Th1/Th2的平衡，抑制抗原引起Th2细胞的分化而强化Th1细胞的活性，从而达到抑制变应性疾病的发生[9]。Treg细胞的数量减少和功能减退，在AR的发病过程中发挥着重要的作用[10]。Foxp3是Treg细胞特异的分子标志物，决定Treg细胞发育、分化及发挥功能的关键特征性的转录因子，对Treg细胞的免疫抑制活性具有至关重要的作用[12]，Treg细胞发挥免疫调节作用依赖于Foxp3高水平稳定表达，Treg细胞的功能低下可能导致变应性疾病发生[16]。

AR属于中医学中的“鼻鼽”范畴，有多种证型，其中肺气虚寒型较为常见，本研究通过检测不同分类与分度的肺气虚寒型AR患者ROR-γt mRNA及Foxp3 mRNA的表达，结果表明，在19例肺气虚寒型AR患者外周血中，ROR-γt mRNA表达上调，而Foxp3 mRNA表达下调，ROR-γt/Foxp3 mRNA水平显著高于对照组，肺气虚寒型AR患者Th17/Treg细胞中转录因子表达失衡。在不同分类与分度的肺气虚寒型AR患者外周血中，中-重度持续性AR组ROR-γt mRNA表达上调，而Foxp3 mRNA表达下调，ROR-γt/Foxp3 mRNA水平显著显著高于对照组，但轻度间歇性、持续性、中-重度间歇性的ROR-γt mRNA表达及Foxp3 mRNA表达与对照组相比不明显，ROR-γt/Foxp3 mRNA表达失衡不显著，可能与AR发生发展存在一定的关联性，在AR发展的早期，可能并没有出现Th17/Treg细胞的免疫失衡。

中医学对AR发病机制的认识是“由于内因、外因合而致病，内有禀赋的异常，外有接触风邪、寒邪、异气的经历，方能发病”，国医大师干祖望先生认为，本病与漆疮同属一类[17]。在《外科正宗·卷四》提到：“漆疮由来自异，有感而弗感也”，认为人接触油漆之后发不发病关键在于自身，并进一步指出了“有感而弗感”的原因在于“人之秉质有偏，腠理不密”，明确提出先天体质的异常是变应性疾病发生的基础，秉质有偏，或称为“体质特异”，是本病发病的内因，风邪、寒邪、异气与西医学中的变应原等同。从轻度间歇性，轻度持续性，到中-重度间歇性及持续性的发病发展过程中，不断有外邪的入侵及诱发，可能Th17/Treg细胞的免疫失衡也处于动态变化中，中-重度持续性AR患者，进入完全的Th17/Treg细胞的免疫失衡。