LMP1、COX-2、VEGF、IL-8 与鼻咽癌复发转移的相关性研究*

白薇琦 俞吉霞 郑传胜

鼻咽癌是我国南方常见的一种多发性恶性肿瘤，南北地区发病率的差异较为明显[1]，WHO粗略的统计报道中提到，中国占世界上鼻咽癌患者的发病率达80%[2]，是常见的一种头颈部恶性肿瘤，且鼻咽癌早期即可发生淋巴结转移。EB病毒是一种具有致瘤潜能的DNA疱疹病毒，其中的一种潜伏性膜蛋白-1（LMP1）已经被具有促进细胞恶变的作用，同时对鼻咽癌细胞的增殖和凋亡具有明显影响[3]。环氧化酶-2（COX-2）是花生四烯酸转化为前列腺素的一种限速酶，在多种恶性肿瘤中过表达[4，5]，且与肿瘤的发生有密切联系，同时在肿瘤血管的形成中起着重要的作用。血管内皮生长因子（VEGF）促淋巴管生成作用强大，多与肿瘤淋巴转移相关[6]。而近年来国外学者在一些新发现的具有强烈作用促肿瘤血管生成的细胞因子中，白细胞介素-8（IL-8）作为血管生成因子，与肿瘤的发生发展具有重要作用[7]。本次研究通过对不同人群中的LMP1、COX-2、VEGF和IL-8进行检测，分析以上指标对鼻咽癌患者的复发和预后是否具有相关性，为提高患者的生存质量提供有效证据。

资料与方法

1 一般资料

选取自2010年3月～2016年12月间，就诊于我院诊断为鼻咽癌的患者共100例，所有患者均经病理组织学确诊为鼻咽癌。同时所有患者在开始治疗前均接受了以下相关检查并进行病情评估：电子鼻咽镜及内镜下活检、头颈部核磁共振(MRI)检查、胸部CT检查、腹部超声检查、全身骨扫描、血常规、血液生化、心电图及牙齿检查等。此外，对随诊复查的患者也行电子鼻咽镜检查、头颈部MRI以及针对远处转移灶的相关影像学检查。鼻咽癌的常见的远处转移灶部位骨、肝、肺、远处淋巴结（指位于头颈部以外的非区域淋巴结，如纵隔淋巴结、腋窝淋巴结等）、脑。依据上述检查结果，将患者分为对照组（初诊为鼻咽癌不伴鼻咽癌的转移）和观察组（患者为鼻咽癌复发或转移患者），各50例。其中对照组男 30例，女 20例；年龄 22～73岁，平均（48.3±5.0）岁；病理分型：角化型分化性鳞状细胞癌4例，非角化型分化性鳞状细胞癌25例，未分化癌21例。观察组男28例，女22例；年龄24～72岁，平均（47.5±5.2）岁；病理分型：角化型分化性鳞状细胞癌3例，非角化型分化性鳞状细胞癌26例，未分化癌21例，不伴转移患者25例，伴有转移患者25例。两组患者性别、年龄、病理分型差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本次研究已通过本院伦理委员会批准，且告知患者及家属并签署知情同意书。

2 方法

收集鼻咽癌患者新鲜手术切除组织或活检组织，立即行10%的福尔马林对组织标本进行固定，后进行石蜡包埋，常规切片4μm，使用免疫组化法检测组织中LMP1、COX-2、VEGF的表达。另外，收集患者晨起空腹血3ml，离心后，将血清保存于-80℃，用于IL-8的检测。比较两组患者组织中LMP1、COX-2、VEGF及血清中IL-8的表达情况。另外，对观察组中无鼻咽癌转移和伴鼻咽癌转移的患者间上述指标的表达情况进行比较分析。同时，对鼻咽癌复发和转移进行多因素分析。

免疫组化法检测结果为棕黄色提示为阳性，将每张切片放置在显微镜（×400）下对5个不同视野的癌细胞计数进行选取，每个视野选取100个。把每个视野着色所占比分为0～4级，0级：0%～5%；1级：6%～25%；2级：26%～50%；3级：51%～75%；4级：75%～100%[8]。同时根据切片中癌组织着色细胞的染色强弱程度进行评分，0级：阴性；1级：棕黄色细颗粒，弱阳性；2级：棕黄色颗粒（介于1级与3级之间），阳性；3级：棕黄色粗颗粒，强阳性。将以上两种判定标准的结果相乘，计算分值，其中0～1分为阴性；2～12 分为阳性[9]。

本次研究所使用的鼠抗人LMP1单克隆抗体由北京中杉生物技术开发公司提供，鼠抗人COX-2单克隆抗体、DAB显色剂由武汉博士德生物工程有限公司提供，鼠抗人VEGF单克隆抗体与S-P超敏试剂盒均由福州迈新生物技术开发公司提供，兔抗人IL-8多克隆抗体由第四军医大学免疫学教研室提供，IL-8 ELISA试剂盒由美国R&D公司提供。

3 统计学方法

应用SPSS 21.0统计学软件进行数据处理与统计分析。服从正态分布的计量资料统计描述采用均数±标准差（±s）表示，统计分析采用两独立样本t检验。计数资料统计描述以百分率表示，统计分析采用χ2检验。危险因素多因素分析采用Cox比例风险回归模型。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 两组患者LMP1、COX-2、VEGF和IL-8的表达情况的比较

观察组组织中COX-2和VEGF表达的阳性率均显著高于对照组（P＜0.001），LMP1的阳性率明显低于对照组（P＜0.001），另外观察组血清中IL-8的表达水平较对照组明显增高（P＜0.001），见表1。

表1 两组患者LMP1、COX-2、VEGF和IL-8的表达情况的比较

2 观察组组内LMP1、COX-2、VEGF和IL-8的表达情况比较

观察组伴鼻咽癌转移患者COX-2和VEGF表达的阳性率较无转移患者明显增高（P＜0.05），且LMP1表达的阳性率明显低于无转移患者（P＜0.01），另外伴鼻咽癌转移患者血清中IL-8的表达水平较无转移患者明显增高（P＜0.05），见表2。

表2 观察组组内LMP1、COX-2、VEGF和IL-8的表达情况比较

3 鼻咽癌复发相关因素的Cox回归多因素分析

以 LMP1、COX-2、VEGF 和 IL-8 为自变量，以复发为因变量，对其相关性进行分析，结果显示COX-2、VEGF和IL-8的表达水平与鼻咽癌的复发呈正相关（P＜0.05），而LMP1的表达水平与鼻咽癌的复发呈负相关（P＜0.01），见表 3。

表3 鼻咽癌复发相关因素的Cox回归多因素分析

4 影响鼻咽癌转移的多因素分析

以 LMP1、COX-2、VEGF 和 IL-8 为自变量，以转移为因变量，对其相关性进行分析，结果显示VEGF和IL-8的表达水平与鼻咽癌的远处转移呈正相关（P＜0.05），LMP1的表达水平与鼻咽癌的转移呈负相关（P＜0.01），见表 4。

表4 鼻咽癌复发转移相关因素的Cox回归多因素分析

讨论

LMP1可转化成纤维细胞、原代B细胞和上皮细胞，其被纳入癌基因之列，国外也有类似的研究[9-11]，他们将LMP1转染给EBV阴性的胃癌患者后，结果发现LMP1提高了细胞凋亡的敏感性，使得细胞的生长率、殖入力、细胞级别和致瘤能力降低。在对霍奇金淋巴瘤患者的预后观察中还发现[12]，LMP1阳性患者的复发率更高，存活期更长。由此我们可认为鼻咽癌的发展过程中，LMP1的基因表达会随着体内的环境而发生变化。在早期致癌因素的影响下，LMP1分子会通过突变而降低患者的免疫功能，并调控部分信号转导，让肿瘤增殖并形成，加快了细胞恶化的进程，成为更具有异质性的肿瘤[13]。本次研究发现观察组患者LMP1的表达水平显著低于对照组患者（P＜0.001），且观察组中发生NPC转移的患者LMP1表达水平较无转移患者也明显降低（P＜0.01），提示有复发转移的风险的患者体内的LMP1阳性表达相比无复发转移的患者更为低。有研究指出[14]，VEGF在人类的多种肿瘤患者中表达率高，且高度恶性的肿瘤患者中VEGF表达还显著高于低度恶性肿瘤患者，并以自分泌或旁分泌作用于血管内皮细胞或肿瘤细胞，一旦出现VEGF高表达，则提示肿瘤预后差[15]。VEGF还能促进肿瘤血管的形成，和肿瘤的生长、转移、浸润都具有密切的关系。相关研究指出[16]，VEGF还与复发转移相关，也就是说VEGF高表达患者更容易出现转移，生存期下降。我们的研究发现，将VEGF作为自变量，复发和转移作为因变量，结果发现，VEGF的阳性表达还与复发和复发转移相关，说明VEGF作为预判复发和复发转移的独立预后因素。

COX属于花生四烯酸合成前列腺素的一个限速酶，属于诱导性表达，通常在静息状态下并不会表达，在正常组织中不会被发现，只有在受到癌基因刺激后会迅速合成[14]。COX-2在鼻咽癌中的表达较高，会促进肿瘤新生血管的形成，并抑制DNA的修复[15]。本次研究发现，观察组患者体内的COX-2阳性表达水平明显高于对照组（P＜0.01），同时经Cox回归多因素分析发现，COX-2对复发患者有预警作用（P＜0.01），但对于复发转移则显得不那么敏感。IL-8是近年来研究较多的一种血管生成促因子，在多种恶性肿瘤中已经被检出，包括肺癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞和膀胱癌细胞等[16]。我们的研究发现，观察组转移患者的IL-8的阳性表达显著高于对照组与复发患者（P＜0.001），且复发患者的IL-8的阳性表达也高于对照组（P＜0.01），提示有转移的风险的患者体内的IL-8阳性表达相比复发和未转移的患者更为显著，且在进一步的多因素回归分析中发现，IL-8则与鼻咽癌的复发有一定相关性（P＜0.05），进一步证明了可将IL-8作为影响鼻咽癌的复发的独立预后因素。

综上所述，LMP1、COX-2、VEGF 和 IL-8 的异常表达在整个鼻咽癌的发生发展中可能起协同作用，早期可通过对上述指标的联合检测对疾病做出诊断，并及时拟定治疗方案，为提高患者的预后提供临床指导。