栀子水提浸膏中化学成分分析及主要成分的含量测定研究

2019-01-04周严严祖力皮亚赵海誉边宝林王宏洁

浙江中医药大学学报 2018年12期

周严严祖力皮亚,2 赵海誉边宝林王宏洁

1.中国中医科学院中药研究所北京 100700 2.首都医科大学

中药栀子来源于茜草科植物栀子（Gardenia jasminoides Ellis）的干燥成熟果实，为常用中药。栀子原名卮子，始载于《神农本草经》，列为中品。栀子性寒、味苦、无毒，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒的功效[1-3]。现代植物化学研究发现，栀子中含有大量的环烯醚萜类化合物，同时还存在一些单萜、二萜、三萜、黄酮、香豆素等，其中环烯醚萜类成分为栀子属植物的特征性成分[4-5]。

本研究以纯净水作为溶剂提取制备栀子水提浸膏，首先采用超高效液相高分辨质谱联用技术（ultra high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry，UHPLC-MS）对栀子水提浸膏主要化学成分进行分析。通过查阅文献发现，2015年版《中华人民共和国药典》中仅以栀子苷作为栀子质量控制的唯一含量测定指标[6]，未能全面地反映出栀子药材的内在质量。既往研究报道，栀子水提浸膏中栀子苷和京尼平1-β-D-龙胆双糖苷的含量较高[7-9]，本研究前期预实验也证实了这点，因此本文采取高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定栀子水提浸膏中主要成分栀子苷、京尼平1-β-D-龙胆双糖苷的含量，为后续研究栀子配方颗粒及其药效提供物质基础。

1 材料和方法

1.1 仪器 Ultimate 3000超高效液相色谱仪（含自动进样器、柱温箱、在线真空脱气机、低压四元梯度泵、PDA检测器）和LTQ Orbitrap velos pro质谱仪含高分辨静电场轨道阱质谱、电喷雾离子源（electron spray ionization，ESI）购自美国 Thermo Fisher公司；LC 20AT液相色谱仪购于岛津企业管理中国有限公司；Heidolph旋转蒸发仪为德国Ika公司产品；KQ-250B型超声波清洗器购于昆山市超声仪器有限公司；XA105-METTLER TOLEDO十万分之一电子天平、JA503-DuaIRange万分之一电子天平购于上海舜字恒平科学仪器有限公司。

1.2 材料和试剂对照品：栀子苷、京尼平1-β-D-龙胆双糖苷、羟异栀子苷对照品均购于北京赛百草科技有限公司（批号：17060703、16021804、SH7032103），HPLC纯度≥98%。供试品：栀子购于北京仟草中药饮片有限公司（产地：江西；批号：160803001）。甲醇、甲酸、乙腈均购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司（批号：174486、168642、175160）。

1.3 方法

1.3.1 栀子水提浸膏的制备称取中药材栀子450g，以纯净水回流提取2次，第1次用8倍量的水，第2次用6倍量的水，每次2h。过滤，合并滤液，常压浓缩到不流动状态，即得栀子水提浸膏。

1.3.2 对照品与供试品溶液的制备

1.3.2.1 对照品溶液的制备分别精密称取栀子苷、京尼平1-β-D-龙胆双糖苷、羟异栀子苷对照品5mg，置于5mL容量瓶，加甲醇溶解至5mL，定容，使终浓度为1mg·mL-1，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得各对照品溶液。

1.3.2.2 供试品溶液的制备称取栀子水提浸膏1mg，置于10mL容量瓶，加甲醇溶解并稀释至10mL，摇匀，即得供试品溶液。

1.3.3 色谱条件

1.3.3.1 化学成分鉴定色谱条件色谱柱：Agilent Extend-C18 柱（3.0mm×150mm，3.5μm）；柱温：45℃；流动相为A（乙腈）和B（0.1%甲酸-水），梯度洗脱0～20min，10%～50%A；20～30min，50%～95%A；30～36min，95%A；流速：0.3mL·min-1；进样体积：对照品为 5μL，供试品为2μL。

1.3.3.2 含量测定色谱条件色谱柱：phenomenex-C18 柱(4.6mm×150mm，5μm)；流动相：乙腈-水（12:88）；流速：1mL·min-1；柱温：30℃；进样体积：10μL，时间：30min；在线紫外波长扫描范围：200～400nm。

④应创新管理机制，提高队伍素质。深化用人制度改革。积极推行全员聘用制度和岗位管理制度，对全体职工实行竞争上岗、持证上岗，以岗定责，以岗定酬，用人机制逐步从过去的固定用人、身份管理向合同用人、岗位管理转变。积极做好基层水利职工培训工作，提高队伍素质。推荐基层干部到更高层次机关单位挂职锻炼；利用国家鼓励大学毕业生、研究生等高素质人才到基层工作的契机，吸纳更多高素质人才进入基层水利队伍。

1.3.4 质谱条件 ESI源参数设定如下：正负离子扫描模式，正离子模式下毛细管温度为350℃，毛细管电压为35V，喷雾电压为3.5kV，鞘气（N2）流速为40psi，辅助气（N2）流速为 10psi；负离子模式下毛细管电压为35V，喷雾电压为3.5kV，鞘气（N2）流速为35psi，辅助气（N2）流速为10psi。样品一级质谱在FT模式下进行全扫描，分辨率R为30 000，m/z扫描范围为150～1 000，二级及三级质谱采用数据依赖性扫描（data dependent scan）。数据采集和分析采用Xcalibur，Metworks和 Mass Frontier 7.0 软件。

2 结果

2.1 UHPLC-MS/MS技术鉴定与比较栀子水提浸膏的主要化学成分根据已知化合物的质谱裂解碎片及结构，推导出不同类型化合物的质谱裂解规律。借助上述不同种类化合物的裂解规律和未知化合物的裂解碎片，与参考文献[10-12]对比，栀子水提浸膏中共推导鉴定化合物16种，包括环烯醚萜类7种、有机酸类3种、黄酮类2种、其他类4种。见图1-2和表1。

在保留时间6.09min下，栀子苷准分子离子峰m/z 389.1456[M+H]+及 m/z 387.1286[M-H]-，其相对分子质量388.1311Da。正离子模式下检测到[M+Na]+峰m/z 411.1277，[M+K]+峰 m/z 427.1010 和 [M+HC6H10O5]+峰m/z 227.0920；负离子模式下，可检测到[M+HCOO]-峰 m/z 433.1359，二级碎片离子 m/z 225.0780是由准分子离子峰脱去一分子葡萄糖残基（相对分子质量162Da）产生，并且其相对保留时间、分子离子峰和二级质谱碎片信息与对照品完全一致，故鉴定该化合物为栀子苷，见图3。其裂解方式见图4。说明环烯醚萜类化合物的裂解方式是以糖苷键断裂为主，丢失一分子葡萄糖基(相对分子质量162Da)和H2O。

图1 栀子水提浸膏总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms in water extracts of Gardenia jasminoides

图2 栀子苷对照品与栀子水提浸膏中栀子苷二级质谱图Fig.2 MS/MS spectrum of geniposide reference and geniposide in water extracts of Gardenia jasminoides

图3 正离子模式下栀子苷的裂解方式示意图Fig.3 Schematic diagram of the cleavage mode of geniposide in positive ion mode

在保留时间4.77min下，京尼平1-β-D-龙单双糖苷准分子离子峰m/z 549.1824[M-H]-及m/z 551.1989[M+H]+，其相对分子质量550.1989Da。正离子模式下检测到[M+Na]+峰 m/z 573.1810，[M+K]+峰 m/z 589.1529，[M+H-glc]+峰 m/z 389.1454 和 [M+H-2glc]+峰 m/z 227.0922；负离子模式下可检测到[M+HCOO]-峰m/z 559.1891，与负离子模式下检测到的对照品比较，相对保留时间、分子离子峰和二级质谱碎片信息都完全一致，则可确定此化合物为京尼平1-β-D-龙单双糖苷。见图4。

羟异栀子苷准分子离子峰m/z 403.1245[M-H]-，负离子模式下可检测到[M+HCOO]-峰m/z 449.1290，二级碎片离子m/z 241.0720，是由准分子离子峰脱去一分子葡萄糖残基（相对分子质量162Da）产生，并且其相对保留时间、分子离子峰和二级质谱碎片信息与对照品完全一致，故鉴定该化合物为羟异栀子苷。见图5。

化合物2和化合物11（已知化合物栀子苷）裂解碎片相对一致，说明两者都是环烯醚萜类化合物。化合物2的保留时间为2.71min，且高分辨质谱给出其分子式为C16H22O10，误差值0.738ppm。负离子模式下，化合物2的特征性碎片m/z 373.1140，化合物11的特征性碎片m/z 387.1298，由此可以推测，化合物2是由化合物11失去一个甲基、加一个氢而来，化合物11为栀子苷，由此可推测化合物2为栀子苷酸。栀子苷酸化学结构图见图6。

图4 京尼平1-β-D-龙胆双糖苷对照品与栀子水提浸膏中京尼平1-β-D-龙胆双糖苷二级质谱图Fig.4 MS/MS spectrum of genipin 1-β-D-gentiobiolycosidereference and genipin 1-β-D-gentiobiolycosidein water extracts of Gardenia jasminoides

图5 羟异栀子苷对照品与栀子水提浸膏中羟异栀子苷的二级质谱对比图Fig.5 MS/MS spectrum of gardenoside reference and gardenoside in water extracts of Gardenia jasminoides

图6 栀子苷酸的化学结构图Fig.6 Chemical structure diagram of geniposidic acid

2.2 HPLC法测定栀子水提浸膏中主要成分的含量

2.2.1 波长的确定分别适量取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪进行全波长扫描，分别在238、254、280、310、330、350、370nm 下提取色谱图。根据色谱图分析比较，在238nm下，样品中主要成分栀子苷和京尼平1-β-D-龙胆双糖苷的分离度和响应值高，结合药典因此确定测定栀子苷和京尼平1-β-D-龙胆双糖苷的测定波长为238nm。见图7-8。

2.2.2 流动相的选择按《中华人民共和国药典》2015年版栀子项下测定法[6]，流动相选择为乙腈与水，进行不同比例的一系列实验，流动相的比例分别为1:99、10:90、12:88、15:85。根据栀子主要成分栀子苷和京尼平1-β-D-龙胆双糖苷的响应值和分离度结果，选择流动相乙腈与水百分比例为12:88。流动相百分比为12:88时，栀子苷和京尼平1-β-D-龙胆双糖苷的响应值和分离度较好，色谱峰的对称度较好。

2.2.3 方法学考察

2.2.3.1 标准曲线精密称取栀子苷对照品5.34mg，以甲醇配成 534、106.8、53.40、26.70、13.35、6.68μg·mL-16种浓度的溶液，以进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标进行回归分析，得到回归方程为：y=14 339x-63 120（r=0.9997，n=6）；精密称取京尼平 1-β-D-龙胆双糖苷对照品2.00mg，以甲醇配成500、100、50、25、12.5、6.25μg·mL-1共 6 种浓度溶液，以进样量为横坐标，以峰面积为纵坐标进行回归分析，得到回归方程为 y=6 802.20x-28 631（r=0.9998，n=6）。

表1 栀子水提浸膏中化合物的质谱信息Tab.1 Mass spectrometry information for compounds in Gardenia jasminoides

图7 栀子苷对照品和京尼平1-β-D-龙胆双糖苷对照品色谱图Fig.7 HPLC chromatograms of geniposide and genipin 1-β-D-gentiobiolycoside

图8 栀子水提浸膏色谱图Fig.8 HPLC chromatogram of water extracts of Gardenia jasminoides

2.2.3.2 精密度相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）实验取含浓度为53.40μg·mL-1的栀子苷和50.00μg·mL-1的京尼平1-β-D龙胆双糖苷混合标准品溶液，进样10μL，连续测定5次，记录峰面积，栀子苷，RSD值为0.49%，京尼平1-β-D龙胆双糖苷RSD值为0.55%，均符合方法学要求。

2.2.3.3 稳定性实验取栀子水提浸膏一份，分别于0、2、4、6、8、12h 测定栀子水提浸膏中的栀子苷和京尼平1-β-D-龙胆双糖苷的峰面积。栀子水提浸膏中的栀子苷和京尼平1-β-D-龙胆双糖苷的RSD值分别为0.40%、0.50%，结果表明栀子水提浸膏中栀子苷和京尼平1-β-D-龙胆双糖苷均在12h内保持稳定。

2.2.3.4 重复性实验精密称取6份栀子水提浸膏各10mg，分别加甲醇25mL溶解，超声处理30min，摇匀；再从中精密吸取1mL，置5mL容量瓶，加甲醇至5mL，稀释，摇匀，即得供试品溶液，测定两种主要成分在水提浸膏中的含量。栀子水提浸膏中栀子苷含量RSD值为2.13%，京尼平1-β-D龙胆双糖苷RSD值为2.12%。

2.2.3.5 加样回收率各取已知含量的栀子水提浸膏6份，精密加入栀子苷对照品和京尼平1-β-D-龙单双糖苷对照品，按样品测定方法制备供试品溶液，测定，测得平均回收率分别为102.68%和103.48%。见表2-3。

2.2.3.6 含量测定结果栀子水提浸膏中栀子苷和京尼平1-β-D-龙胆双糖苷的平均含量分别为13.42%和4.88%。见表4。

表2 栀子水提浸膏中栀子苷成分的回收率结果Tab.2 Recovery results of jasminoidin in water extract solution of Gardenia jasminoides

3 讨论

本实验采用纯净水制备栀子水提浸膏，对水提浸膏中主要化学成分进行了UHPLC-MS鉴定分析，同时对其中含量较高的两种成分栀子苷和京尼平1-β-D-龙胆双糖苷进行了含量测定。

基于UHPLC-MS技术，根据质谱裂解碎片和文献对比，栀子水提浸膏中共推导鉴定化合物16种，包括环烯醚萜类7种（鸡矢藤次苷甲酯、栀子苷酸、羟异栀子苷、山栀子苷、京尼平1-β-D-龙单双糖苷、栀子苷、6″-对香豆酰基京尼平龙单双糖苷），有机酸类3种[咖啡酸、3-O-咖啡酰奎尼酸、3,4-咖啡酰-5-（3-羟基-3-甲基戊二酰）奎尼酸]，黄酮类2种（芒果苷、新芒果苷），其他类4种（Jasninoside B、反式红花苷、顺势红花苷、西红花苷）。通过对栀子水提浸膏中主要化学成分进行鉴定分析，明确了栀子水提浸膏的主要化学成分模式。羟异栀子苷由于已有标准品，所以也对其进行了裂解规律分析。但是羟异栀子苷在原药材中的含量较少，经过水提之后含量会更低，故无法进行含量测定。同时通过液质分析提取羟异栀子苷的精确分子量有多个峰，说明其存在同分异构体，所以并未对其进行含量测定。在HPLC图谱中从峰面积角度观察到两个主峰是栀子苷和京尼平1-β-D-龙胆双糖苷，因此本研究同时对栀子水提浸膏中的栀子苷和京尼平1-β-D-龙胆双糖苷两种成分进行了含量测定研究。结果表明栀子水提浸膏中栀子苷和京尼平1-β-D-龙胆双糖苷的平均含量分别为13.42%和4.88%，此栀子质量达到要求。说明此方法稳定简便，为以后在药典中增加京尼平1-β-D-龙胆双糖苷为栀子含量测定指标提供基础，同时为后续栀子配方颗粒的药效研究提供了物质基础。