细梗香草总皂苷联合5-氟尿嘧啶抗胆管癌作用及其机制研究

汪洋 张筱凤 汪静 金杭斌 黄海琇 王雨承 杨建锋

1.南京医科大学附属杭州医院 杭州 310006 2.杭州市老年病医院

胆管癌是一种起源于上皮细胞的恶性肿瘤，根据解剖部位可分为肝内胆管癌和肝外胆管癌。胆管癌早期症状不典型，实验室常规及影像检查也缺乏特异性，因此早期诊断困难。当出现黄疸等症状时，往往已处于进展期。大多数胆管癌都是腺癌，手术治疗是其首选治疗方式，但肿瘤易侵犯血管和淋巴结，手术切除范围广，并发症多，手术总体效果并不佳，且多数胆管癌患者确诊时已失去手术机会。对于无法手术的患者，全身化疗是主要治疗方案，然而胆管癌细胞具有高度促结缔组织增生能力和异质性，同时肿瘤微环境复杂，导致其化疗效果不佳。由于胆管癌总体预后差，生存期短，因此对于进展期胆管癌，研发新的药物是改善患者预后的方向之一。

目前，寻找天然中草药的有效成分是抗肿瘤药物研究的方法之一。细梗香草性甘，味平，全草入药，民间用于治疗风湿痹痛、月经不调、咳喘，并有补虚、驱蛔之功效。体内外研究证实细梗香草总皂苷（Lysimachia capilliposide，LC）对多种肿瘤有抑制作用[1-5]。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-Fu）在多种恶性肿瘤的治疗中得到广泛应用，是消化系统肿瘤的常用化疗药，在结直肠癌、胃癌、肝癌等恶性肿瘤的化疗中都有运用，临床上多以联合用药为主，如联合亚叶酸、奥沙利铂和伊立替康可作为晚期结直肠癌的一线化疗方案[6-7]。在临床使用过程中，5-Fu可导致多种不良反应，骨髓抑制是其中最常见的毒性反应，其它诸如手足综合征、口腔炎、神经和心脏毒性等也时有发生，当然这些不良反应的发生和5-Fu的连续使用有关。另外一些与药物剂型、剂量和持续输注有关的副反应包括恶心呕吐、腹泻、脱发和皮炎等。目前临床上应用以新一代的氟尿嘧啶药物前体为主，疗效更好，毒副反应也更小[8]。

研究发现许多中药与5-Fu联合使用有增效、减毒的效果，也值得进一步探究[9]。本文以人源胆管癌细胞株QBC939细胞为研究对象，研究LC单独及与5-Fu联用的抗胆管癌作用，并明确其作用机制，为胆管癌的中西医结合治疗寻找新的突破口；同时进一步阐明LC的抗肿瘤作用机制，为LC作为抗肿瘤药物的开发研究提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 药物及细胞株 人胆管癌细胞株QBC939由杭州市第一人民医院转化医学中心提供。5-Fu注射液为天津金耀药业公司产品（批号：H12020959），剂量为0.25g:10mL。LC由浙江大学生物医学工程学系实验室提供。

1.1.2 主要试剂 RPMI 1640培养基、Trypsin-EDTA（0.25%）胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素-链霉素均购于 美国 Gibco 公 司 （批 号 ：11875093、25200056、10099141、15140122）；3-（4,5-二甲基吡啶-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑内盐[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-etrazolium inner salt，MTS]细胞增殖试剂盒（比色法）购于美国艾美捷科技有限公司（批号：K300-500）；Annexin Ⅴ/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒购于美国BD公司（批号：556547）；细胞周期检测试剂盒购于杭州联科生物技术有限公司（批号：CCS012）；天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶-3（cysteine aspartic acid specific protease-3，caspase-3）抗体、多聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase，PARP）抗体均购于美国CST公司（批号：9665T、9542T）。相应二抗及β-actin内参抗体均购于美国Abbkine公司（批号：A21020、A01010）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 QBC939细胞培养于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中。培养条件为37℃、5%CO2、饱和湿度。细胞单层贴壁生长，至70%～80%融合时以胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 细胞增殖抑制率检测 前期预实验结果提示0.1～1 000μg·mL-1的 5-Fu作用 48h和 72h 对胆管癌细胞增殖有抑制作用；浓度为16～128μg·mL-1的LC作用24h、浓度2～32μg·mL-1的 LC作用48h及72h对胆管癌细胞增殖也有抑制作用。依据预实验结果，将消化传代后的QBC939细胞以培养基重悬为单细胞悬液，以5×103个/孔的数量接种于96孔板中，培养过夜后分别加入5-Fu和LC，使5-Fu终浓度分别为 0、0.1、1、10、100、1 000μg·mL-1，LC 终浓度分别为0、2、4、8、16、32μg·mL-1，继续培养 48h。采用 MTS 法检测，先加入培养基100μL/孔，再加入MTS试剂20μL/孔，继续培养1h，用酶标仪测定490nm吸光度OD490。细胞存活率=（OD490实验孔-OD490空白孔）/（OD490对照孔-OD490空白孔）×100%。实验重复3次，取平均值，再以细胞存活率为纵坐标，药物浓度以10为底的对数值为横坐标，用Graphpad Prism软件绘制量效曲线，计算出两药各自的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50）。

1.2.3 药物联用实验 QBC939细胞以5×103个/孔的数量接种于96孔板中，培养过夜后加入药物，0、1、3、5、7μg·mL-1的 5-Fu 分别与 0、4、6、8、10μg·mL-1的LC进行组合，5×5共有25种组合，各组均培养48h。采用MTS法检测并计算各药物浓度下细胞增殖抑制率，再计算药物联合作用指数(combined index，CI)判断两种药物的协同性。CI=DA/ICX-A+DB/ICXB，其中A、B代表两种不同药物，ICX-A和ICX-B是两种药物单独使用使细胞增殖抑制率达X时的药物浓度，DA和DB是两药联用使细胞增殖抑制率达X时两种药物的浓度。运用Calcusyn 2.0软件计算LC与5-Fu的CI值。当CI值小于1时，提示两药联用有协同作用，且数值越小，协同作用越强；CI值等于1时，说明两药联用有叠加作用；大于1时，说明两药联用有拮抗作用[9]。

1.2.4 细胞分组 根据CI及细胞增殖抑制率实验结果，将细胞分为以下4组：（1）空白对照组：不加药物干预；（2）5-Fu单药组：仅使用 5-Fu单药；（3）LC 单药组：仅使用LC单药；（4）联合用药组：联合使用5-Fu和LC。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期分布选取对数生长期的QBC939细胞，以2×105个/孔的数量接种于6孔板中，培养24h后分为A、B、C、D组，加入不同浓度药物，继续培养48h后用不含EDTA的胰酶消化，800r/min、4℃离心5min后收集细胞。以预冷的PBS洗涤2次，800r/min、4℃离心5min。收集细胞，调整细胞数量约为 3×105，加入 1×Binding Buffer 100μL重悬细胞，再分别加入AnnexinⅤ-FITC 5μL和PI染液5μL，轻轻混匀。避光、室温反应15min后加入1×Binding Buffer 400μL，混匀后1h内用流式细胞仪检测。另外再收集5×105细胞，PBS洗涤后加入DNA染液500μL和破膜剂10μL，涡旋振荡5～10s混匀，室温避光孵育30min，流式细胞仪检测细胞周期分布。以上实验重复3次。

图1 5-Fu对QBC939细胞的增殖抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of 5-Fu on proliferation of QBC939 cells

1.2.6 Western blot检测凋亡相关蛋白表达 选取对数生长期的QBC939细胞，以2×105个/孔数量接种于6孔板中，分组同前，培养24h后加入不同浓度药物，继续培养48h后收集细胞提取总蛋白。BCA法测定蛋白浓度，制备10%SDS-PAGE凝胶，每孔加入10μg样品进行电泳，半干法转膜，5%脱脂奶粉液封闭1h，分别加入相应一抗（1:1 000稀释），4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1:5 000稀释），室温孵育2h，应用ECL化学发光显色。Image J软件进行条带灰度半定量分析。

1.3 统计学分析 运用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，两组均数的比较采用独立样本t检验，多组均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度5-Fu和LC对QBC939细胞的增殖抑制作用比较 0.1～1 000μg·mL-1的 5-Fu 和 2～32μg·mL-1的LC对QBC939细胞的增殖均有抑制作用，且呈浓度依赖性。见图1-2。5-Fu和LC的IC50分别为3.22μg·mL-1、7.41μg·mL-1。

2.2 药物联用实验及细胞分组 各浓度5-Fu与LC联用CI值均小于1，表明这两种药物联用具有协同作用。见表1。各浓度5-Fu与LC联用的细胞存活率见表2。将表1与表2结果结合，选取5-Fu浓度3μg·mL-1、LC 浓度 4μg·mL-1进行后续研究，故细胞分组为：空白对照组、5-Fu 单药组（3μg·mL-1）、LC 单药组（4μg·mL-1）和联合用药组（5-Fu 3μg·mL-1联合LC 4μg·mL-1）。

图2 LC对QBC939细胞的增殖抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of LC on proliferation of QBC939 cells

表1 各浓度5-Fu与LC联合用药的CI值（μg·mL-1）Tab.1 CI value of each concentration of 5-Fu combined with LC(μg·mL-1)

表2 各浓度5-Fu与LC联合用药的细胞存活率（%）Tab.2 Cell viability of each concentration of 5-Fu combined with LC(%)

2.3 各组细胞凋亡率及细胞周期比较 药物分别干预48h后，两个单药组和联合用药组的早期凋亡率和总凋亡率均高于空白对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；LC单药组的晚期凋亡率也高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。联合用药组早期凋亡率及总凋亡率明显高于两个单药组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表3、图3。与空白对照组比较，5-Fu单药组和联合用药组G1期细胞比例增多，G2期细胞比例减少（P＜0.05）；而 LC 单药组 G1、G2期细胞比例差异无统计学意义（P＞0.05）。各组S期细胞比例差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表4、图4。

2.4 各组细胞凋亡相关蛋白表达比较 Western blot提示，与空白对照组比较，其余3组caspase-3表达增高，PARP表达均减低，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。进一步比较发现，联合用药组PARP表达均低于两个单药组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表5、图5。

表3 各组细胞凋亡率比较（%）Tab.3 Comparison of apoptosis rates in each group（%）

表4 各组细胞的细胞周期分布（%）Tab.4 Cell cycle distribution in each group（%）

图3 各组细胞的凋亡流式分析Fig.3 Flow cytometry analysis on cell apoptosis in each group

图4 流式细胞术分析各组细胞的细胞周期分布Fig.4 Flow cytometry analysis on cell cycle in each group

图5 Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白表达Fig.5 Western blot analysis of apoptosis-related protein expression in each group

表5 各组细胞凋亡相关蛋白相对表达量Tab.5 Relative expression of apoptosis-related proteins in each group

3 讨论

胆管癌发病率居肝胆恶性肿瘤的第2位，仅次于肝细胞癌，约占消化系统肿瘤的3%[10]。目前认为慢性炎症及胆汁淤积的存在是胆管癌发病的高危因素，包括原发性硬化性胆管炎、肝吸虫感染、肝内胆管结石、胆管囊肿、肝炎病毒感染等[11-12]。胆管癌的治疗首选手术切除，但由于早期诊断困难，仅30%患者可行治愈性切除，术后复发率达60%～80%[13]。对于无法手术切除而可以耐受化疗患者，目前通常使用吉西他滨联合顺铂的化疗方案，但研究发现化疗后患者的中位生存期也只有11.6个月[14]。因此，胆管癌总体预后差，生存期较短。

细梗香草为报春花科珍珠菜属植物，主要分布于华南。LC占细梗香草总提取物含量的60%以上，其中又以皂苷B和C为主[15-16]。体内及体外实验证实了LC对胃癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、胰腺癌均有抑制作用[1-5]，但LC对胆管癌的作用及内在机制尚不明确。本文以LC单独以及联合5-Fu作用于胆管癌QBC939细胞，研究其对胆管癌增殖、凋亡的影响，并初步探索其中机制。

吉西他滨是胆管癌的一线化疗药物，前期研究以吉西他滨作为阳性对照药物，实验发现吉西他滨单药能够抑制胆管癌细胞增殖，但与LC联用时CI值均大于1，表明两种药物无协同作用。5-Fu也是胆管癌常用的化疗药物，预实验发现5-Fu与LC联合用药具有协同作用，因此本研究将5-Fu作为阳性对照。3μg·mL-1的 5-Fu 与 4μg·mL-1的 LC 联合作用于胆管癌细胞时，细胞增殖抑制率可达65.3%，CI值为0.638，且两药浓度均小于各自IC50，说明LC可加强5-Fu对胆管癌的化疗效果。

细胞周期中存在检验点，当DNA合成或复制存在差错时，细胞周期会发生阻滞，以进行修复。当细胞遗传物质损伤超过细胞修复能力时则会引发细胞凋亡，但是细胞周期与细胞凋亡调控机制存在较大差别，所以细胞周期阻滞与细胞凋亡的发生并非完全同步。本实验中，LC单药使用及与5-Fu联用均使凋亡细胞比例明显增加，但与5-Fu不同，LC对细胞周期无明显影响，说明LC可能是通过其他通路诱导细胞凋亡，而不改变细胞周期进程。

多数中草药的抗肿瘤作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡而实现[17]，具体包括上调caspases-3，-8，-9和p53/p21的表达，增加Bax/Bcl-2比值，抑制PARP-1的表达等[17-18]。caspase-3作为细胞凋亡的执行者，在两种细胞凋亡途径中均发挥重要作用。本实验证明LC可促进caspase-3的表达，尽管联合用药组caspase-3表达量与单药组差异无统计学意义，但是联合用药组caspase-3表达量均高于任一单药组。PARP是一种DNA修复分子，可以被caspase-3剪切为89kD和24kD两个剪切体，其中89kD剪切体在经中草药干预的肿瘤细胞中普遍上调[18]。本研究过程中也曾观察到这一现象，但由于观察到的次数较少，未进行半定量研究。目前认为抑制PARP表达可增强肿瘤放化疗的疗效，在本研究中也得到证实，因此PARP抑制剂也是抗肿瘤药物研究方向之一[18-19]。

综上所述，本研究证实LC与5-Fu具有协同作用，在体外可抑制胆管癌细胞增殖并诱导细胞凋亡，其机制可能与调控caspase-3和PARP表达有关。本研究的结果为LC临床用于胆管癌治疗以及LC的抗胆管癌分子机制提供了实验依据，后续研究中将进一步继续深入研究基因水平的调控机制。