Pim-1在原发性肝细胞癌组织中的表达情况及其临床意义

胡小军 李 霄

全球范围内原发性肝细胞癌(Primary hepatocellular carcinoma，PHC)的发病率在恶性肿瘤中位居第六位，死亡率位居第三位，严重威胁人类健康[1]。当前PHC临床诊治的难点在于早期诊断难，术后转移复发快，整体生存率较低。探索PHC发生发展的分子、细胞学机制，寻找可靠的诊断或治疗的分子靶点，对于提高PHC的临床疗效具有重要价值和意义[2-3]。原癌基因Pim-1是丝氨酸/苏氨酸激酶Pim家族的成员之一，其表达产物Pim-1蛋白激酶具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的活性，抑制细胞凋亡并与肿瘤的发生发展相关[4-7]。目前研究显示，Pim-1在大多数肿瘤组织及肿瘤细胞系内呈过表达状态，包括前列腺癌、非小细胞型肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病[8]及食管癌[9]、胃癌[10]、胰腺癌[11]等消化系统恶性肿瘤。亦有研究表明，PHC患者的血清及癌组织中Pim-1的mRNA水平显著升高[12-15]，但其蛋白在PHC组织中的表达规律尚不明确，与临床病理指标和生存时间的关系也研究较少，其临床潜在应用价值不清。针对此问题，本研究收集了136例PHC患者的手术切除标本，并以正常肝组织为对照，检测不同肝组织中Pim-1蛋白的表达情况，并回顾性分析Pim-1蛋白表达与临床病理指标和生存率的关系，以明确其在PHC发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 临床病例

选择自2009年1月—2013年10月，在第四军医大学第一附属医院肝胆外科接受外科手术治疗的136例PHC患者。所有患者术前均未行任何治疗，术后经病理检查确诊为PHC，且手术切缘为阴性。患者基本资料如下：男性85例，女性51例；平均年龄(53.5±23.8)岁，中位年龄49岁。肝脏基础疾病：乙型病毒性肝炎124例、丙型病毒性肝炎8例，其余4例未见明显肝脏基础疾病。术前肝功能Child-Pugh分级：A级84例，B级52例。病理分级情况：59例为高分化，42例为中分化，35例为低分化。TNM分期：Ⅰ期28例、Ⅱ期24例、Ⅲ期47例、Ⅳ期37例。所有患者无其他严重脏器疾病，22例合并1级高血压，19例合并2型糖尿病。

1.2 标本收集与处理

组织标本：收集手术切除的癌组织及距离癌组织2 cm以上的癌旁组织。同时，收集同期手术切除的肝血管瘤标本周围的正常肝组织85例为对照组，其中男性51例，女性为34例；平均年龄(48.2±17.7)岁。两组患者的性别及年龄的构成比差异无统计学意义(P>0.05)。所有标本于离体15 min内完全浸泡于4%福尔马林溶液中固定24 h，然后常规石蜡包埋并切片，切片厚度4 μm。所有受试者均签署书面知情同意。研究协议符合《赫尔辛基宣言》的伦理准则，并由医院伦理委员会批准。

1.3 术后随访及治疗情况

PHC患者出院后，采取门诊复查或电话随访的方式进行术后随访。随访截止日期为2017年6月28日。无瘤生存期(Disease-free survival，DFS)为自手术日至肿瘤复发日期，总生存期(Overall survival，OS)为自手术日至肿瘤复发日期及死亡日期或至末次随访截止日期，以月为单位。随访周期为4～92个月，平均(45.8±28.3)个月，中位时间为44个月。至研究结束时，共有14例失访病例，其中男性9例，女性5例。最终有122例完成随访工作进入研究。术后1月，常规行经导管肝动脉化疗栓塞(Transcatheter arterial chemoembolization，TACE)1～2次。随访过程中如果怀疑肿瘤复发，立即行甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein，AFP)检测及CT、MRI检查确诊。

1.4 免疫组织化学染色方法

采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SP法)进行染色，具体操作步骤参照免疫组化试剂盒说明书进行。操作简述如下：切片常规脱蜡、水化，3% H2O2-甲醇溶液浸泡10 min，抗原热修复3次；血清封闭10 min，然后加入anti-Pim-1的单克隆抗体，4℃过夜。37℃复温45 min后加入羊抗鼠的二抗，37℃孵育30 min，DAB显色5 min，常规衬染、脱水、透明、封片。随机选择5个高倍镜视野，计数100个细胞。观察细胞着色程度，未染色计为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。计算阳性细胞的百分比，<5%为0分，6%～25%为1分，25%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。将两个得分相乘得到分数作为检测结果，其分级标准为：阴性为0分、弱阳性为1～4分、中等阳性为5～8分、强阳性为9～12分，阳性率(%)=[1-(阴性表达例数/总例数)]×100%。根据最终的结果，定义0～4分为低表达，5～12分为高表达。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 不同来源的肝组织中Pim-1蛋白的表达规律

Pim-1蛋白主要表达于癌细胞胞浆中，少数表达于细胞核中，表现为棕黄色或深棕色的颗粒沉积(图1)。122例癌组织、相对应的癌旁组织及85例正常肝组织中，Pim-1的总阳性表达率分别为88.5%、73.0%、69.4%，差异有统计学意义(χ2=13.2530，P=0.0013)。与癌旁组织及正常肝组织比较，癌组织中Pim-1蛋白的总阳性率显著上升，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)；但癌旁组织和正常肝组织中的总阳性率无统计学差异(P>0.05)。提示Pim-1蛋白在PHC组织中的表达量显著升高，其总阳性率为PHC组织>癌旁组织>正常肝组织。

图1 不同肝组织内Pim-1蛋白的表达情况(免疫组化SP法) Figure 1 Expression of Pim-1 protein in different liver tissues by immunohistochemistry(SP) Note：A.HCC tissues；B.Adjacent tissues；C.Normal liver tissues.

Type of liver tissuesCasesPositive expression rateWeak positive rateMedium positive rateStrong positive rateNegative expression ratePHC tissues122 31(25.4)47(38.5)30(24.6)14(11.5)Para cancer tissues122 46(37.7)30(24.6)13(10.7)33(27.0)Normal liver tissues 85 31(36.5)19(22.3)9(10.6)26(30.6)

2.2 PHC组织中Pim-1蛋白表达与临床病理指标的关系

按照IHC染色结果，将122例PHC患者分为低表达组45例和高表达组77例，对比分析两组患者的临床病理指标。结果表明，Pim-1蛋白与术前Child-Pugh分级、肿瘤数目、肿瘤直径、淋巴结转移率及TNM分期有关(P>0.05)。与Pim-1低表达组的患者比较，高表达组患者的术前Child-Pugh分级较差、肿瘤数目较多、肿瘤直径较大、淋巴结转移发生率较高，且TNM分期较高，病情总体处于进展期；而性别、年龄、肿瘤分化程度、门脉侵犯发生率和术前血清AFP含量在两组患者间无统计学差异(P>0.05)(表2)。

2.3 Pim-1表达与患者生存期的关系

生存分析结果表明，低表达组中位DFS为34.3个月，其95%置信区间为(21.9～46.1)；中位OS为45.2个月，其95%置信区间为(37.7～52.3)个月。高表达组中位DFS为17.5个月，其95%置信区间为(11.5～22.5)；中位OS为23.7个月，其95%置信区间为(18.2～27.8)。Log-rank检验分析表明，低表达组患者的DFS及OS均优于高表达组，差异有统计学意义(χ2=10.895，P=0.001；χ2=9.657，P=0.002)(表3，图2)。

表3 PHC组织中Pim-1表达水平与生存期的关系

表2 PHC组织中Pim-1蛋白表达水平与临床病理指标的关系

图2 PHC组织中Pim-1表达水平与生存期的关系 Figure 2 The relationship between the expression of Pim-1 and survival rate in PHC patients Note：A.Tumor free survival curve；B.Overall survival curve.

2.4 影响PHC患者生存时间的多因素分析

针对本组PHC患者，采用多因素逐步Cox比例风险回归模型对影响患者生存率的危险因素进行统计分析，变量赋值见表4。结果表明，术前较差的肝功能、较低的组织分化程度、门静脉侵犯、出现淋巴结转移、较高的TNM分期和高表达Pim-1蛋白是影响PHC患者生存时间的独立危险因素；而性别、年龄、肿瘤数目、肿瘤直径和术前血清AFP含量与患者总体生存期无关(表5)。

表4 影响PHC患者生存率的危险因素与变量赋值

表5 多因素逐步Cox比例风险回归模型分析影响PHC患者生存期的危险因素

3 讨论

丝氨酸/苏氨酸激酶Pim家族又被称为莫罗尼小鼠白血病病毒前病毒整合位点(Provirusintegration site for moloney murine leukemia virus，Pim)蛋白家族，其生物学本质为钙调蛋白激酶，在脊椎动物中广泛表达且序列保守。PIM家族有Pim-1、Pim-2和Pim-3三个成员，均含ATP锚的活化位点，通过磷酸化底物调控细胞凋亡和细胞周期[16]。

人Pim-1基因定位于染色体6p21.1-p21.31，长约5 kb，由5个内含子和6个外显子组成，其生物学功能与细胞增殖、分化、凋亡以及生长因子信号转导通路等密切相关。在致癌因素作用下，Pim-1基因发生异常高表达，通过调控GSK3B、FOXP3等多种信号通路抑制肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖并阻滞细胞分化成熟[17]，进而增强肿瘤细胞的侵袭和迁移能力[18-19]。但目前关于Pim-1蛋白在PHC中的研究报道目前还较少。Leung等[15]发现Pim-1在PHC组织及出现转移的淋巴结中表达上调，且在细胞实验中证实Pim-1可激活肝癌细胞的糖酵解过程。殷盈祥[20]和董智刚等[21]证实PHC患者外周血中Pim-1的mRNA表达显著上调。而后国内外几个研究小组也都在细胞实验中证实Pim-1与肝癌细胞的增殖、侵袭能力有正相关的关系[12-14]。但这些研究大多为细胞水平实验，对于Pim-1蛋白在PHC组织、癌旁组织和正常肝组织中的表达情况，及其与临床病理指标和生存时间的关系也研究较少，其临床潜在应用价值不清。针对此问题，本研究收集了122例PHC组织、相对应的癌旁组织和85例正常肝组织，以IHC染色方法证实Pim-1蛋白主要表达于PHC组织细胞的胞浆中，少数表达于细胞核中，表现为棕黄色或深棕色的颗粒沉积，这与既往文献报道的结果相一致[15]。Pim-1蛋白在PHC组织中的表达水平显著高于癌旁组织和正常肝组织。按照Pim-1蛋白的表达水平，将PHC患者分为高表达和低表达组。通过回顾性对比分析两组患者的常规临床病理资料，发现高表达组患者在肝内病灶发展、术前肝功能、淋巴结转移和TNM分期等方面，均较低表达组患者有明显恶性进展倾向。进一步的生存分析表明，Pim-1低表达组患者的生存情况显著优于高表达组患者，而多因素Cox分析也明确了Pim-1的高表达是影响本组PHC患者生存率的独立影响因素。有研究表明，在PHC患者发生转移的淋巴结组织中，Pim-1蛋白表达显著过表达，而在细胞水平实验中敲除肝癌细胞内Pim-1的表达，将显著抑制肝癌细胞的侵袭和转移能力[15]。这也部分解释了本研究中Pim-1高表达组患者淋巴结转移发生率较高的现象。当然这一现象背后的具体分子机制尚需进一步研究揭示。

综上所述，本研究首次证实Pim-1在肝癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织和正常肝组织，且与PHC的临床进展和患者生存时间有重要联系，其过表达提示PHC患者的预后较差。Pim-1在PHC诊断、治疗及预后判断等方面具有良好的潜在应用价值与前景。