高危型人乳头状瘤病毒载量和Th1/Th2不均衡表达预测宫颈癌变进程的研究

付艳丽 余 杨 卫 玮 邹晶晶 孙 翔

高危型人乳头状瘤病毒(HR-HPV)持续性感染是导致宫颈上皮内瘤变(CIN)及宫颈癌的主要病因[1-3]。从HPV到CIN到宫颈癌是感染到慢性炎症再到癌变的过程，感染是炎性疾病的始动因素，慢性炎症是HPV的持续性感染，HPV触发的慢性炎症和宿主免疫反应的不足为宫颈癌变提供了可能，因此宫颈癌是一种与慢性炎症密切相关的肿瘤，在炎-癌转化过程中，宫颈局部微环境免疫应答和免疫逃逸在肿瘤发生发展过程中发挥极为重要的作用[4-5]。作为重要的免疫效应细胞，辅助性T细胞(Th)通过分泌特异的细胞因子介导和调节免疫应答，这些细胞因子通过传递细胞之间的分子信号，在炎症和癌变过程中都发挥着重要作用，在不同抗原的刺激下，Th可分化为Thl与Th2两个亚群，Thl型细胞因子，如白细胞介素(IL)-2、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-ɑ(TNF-ɑ)等，主要起免疫刺激功能且能限制肿瘤生长，Th2型细胞因子如IL-4、IL-6、IL-10等，主要起免疫抑制功能且能促进肿瘤生长，两类细胞因子相互制约交互调节共同维持机体的免疫稳态，Thl或Th2优势表达与抗炎/促炎和抗瘤/促瘤并不是简单的因果对应关系，细胞因子浓度、免疫应答作用时间、效应细胞、所处环境等不同条件下，其作用具有多向性和多效性的特点，在病变进程中呈现不同的免疫学特征。本实验同步监测宫颈局部微环境HR-HPV DNA、Thl和Th2型细胞因子变化，分析炎性微环境Th1/Th2不均衡表达与HR-HPV的相互作用及其在宫颈癌和癌前病变的差异性，评估它们作为预测宫颈癌变进程指标的可能性和临床价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择我院2012年1月—2015年9月经液基薄层细胞检测技术(TCT)筛查、HPV基因分型检测(PCR-反向点杂交法)，最终阴道镜下宫颈多点病理活检三阶梯诊疗程序确诊的HR-HPV持续性感染的不同宫颈病变病例，包括CIN214例(其中CINⅠ 71例、CINⅡ 66例、CINⅢ 77例)，宫颈癌125例，年龄34～62岁，中位年龄46.43岁，不同宫颈病变组的年龄无统计学差异，具有可比性。HR-HPV以16型、52型、58型为主，其次为31型、33型，其余为少见分型。入选标准：(1)有1年以上性生活史；(2)2名以上有经验病理科医师确诊；(3)患者本人知情同意，随访资料完整。排除标准：(1)妊娠期妇女；(2)合并其他恶性肿瘤或自身免疫性疾病；(3)近期使用过免疫抑制类药物；(4)HIV阳性；(5)有放化疗史；(6)2周内接受过局部或全身抗病毒药物治疗。参考持续性HR-HPV感染的定义[6-8]：HR-HPV感染者随访1次/6个月，在间隔6～12个月的相邻2次随访中，同一患者的宫颈检测样本均显示HR-HPV阳性且为同种类型，修改为第一年随访1次/4个月，以后至少1次/6个月(依据病情动态监测)，持续时间均在2年以上。以HPV阴性且细胞学检查为正常宫颈的40例健康体检者作为对照组。

1.2 仪器与试剂

PCR扩增仪DA7600型和高危型HPV核酸定量(16、18、31、33、45、52、56、58共8个型)检测试剂盒均由中山大学达安基因公司提供。Th1型细胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-ɑ)和Th2型细胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)共6种均购自上海江莱生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HPV DNA定量检测 无菌条件下采用宫颈刷插入宫颈内，旋转数周后停留片刻取出，将宫颈刷置入无菌管，采集的宫颈分泌物及时送检或4℃保存，一周内检测。DNA提取和PCR扩增按其说明书(PCR荧光法)进行具体操作。判断标准：HPV-DNA>103copies/mL为阳性。根据HR-HPV核酸定量检测的拷贝数分为4组：低载量组(104～105copies/mL)、中载量组(105～106copies/mL)、高载量组(106～107copies/mL)、超高载量组(>107copies/mL)。

1.3.2 细胞因子的检测 将2 mL无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)注入宫颈管内，收集宫颈分泌物，采集的宫颈液经3 500转/min，离心10 min后，分离上清液立即检验或置-20℃冰箱保存待测。采用双抗体夹心ELISA法，严格按说明书进行实验操作。

1.4 统计学处理

应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，病毒载量经Log转换，计量数据用均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，进一步LSD-t(方差齐)或Games-Howell检验(方差不齐)进行多组均数的两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。采用向后-条件逐步回归方法，进行二元多因素Logistic回归分析，检验标准α入=0.05，α出=0.1，筛选预测指标，建立回归模型，评估模型拟合优度和预判准确度。

2 结果

2.1 绘制HR-HPV DNA标准曲线

PCR荧光法阈值设定原则是值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点(图1)，且循环阈值(Ct)不出现任何数值。以标准品4个浓度(1×103～1×106copies/mL)的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线(图2)。Ct值与样本起始模板的拷贝数呈正相关，与起始模板拷贝数对数值间有严格的线性反比关系。

图1 PCR荧光法检测HR-HPV DNA的扩增曲线Figure 1 Amplification curve of HR-HPV DNA detected by PCR fluorescence assay

图2 PCR荧光法检测HR-HPV DNA的标准曲线Figure 2 Standard curve of HR-HPV DNA detected by PCR fluorescence assay

2.2 HR-HPV DNA、Thl和Th2细胞因子等各项预测指标在癌前病变CIN组、宫颈癌组和对照组的比较

宫颈局部HR-HPV DNA和细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-ɑ在CIN组和宫颈癌组之间均有统计学差异(P<0.05)，从CIN到宫颈癌，Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-ɑ的表达水平逐渐降低，Th2型细胞因子IL-4、IL-6、IL-10的表达水平缓慢上升，但均高于无HPV感染的对照组，进一步CIN不同等级组的两两比较：从CINⅠ-CINⅡ-CINⅢ，随着级别的升高，IL-2表达明显降低(P<0.05)，IL-4、IL-6和HR-HPV DNA在CINⅡ和CINⅢ之间无统计学差异(P>0.05)，但表达水平明显高于CINⅠ(P<0.05)；IL-10在CINⅠ和CINⅡ之间无统计学差异(P>0.05)，在CINⅢ急剧增加，明显高于CINⅠ和CINⅡ(P<0.05)；TNF-ɑ表达水平在CINⅢ快速下降，明显低于CINⅠ和CINⅡ(P<0.05)，CINⅠ和CINⅡ之间无统计学差异(P>0.05)；IFN-γ在CINⅡ和CINⅢ之间无统计学差异(P>0.05)，但表达水平明显低于CINⅠ(P<0.05)；和对照组相较，TNF-ɑ/IL-10比值在CINⅡ略下降，从CINⅢ出现明显失衡直至宫颈癌变阶段(表1)。

表1 不同组别患者各项监测指标的单因素分析比较

Note：*P<0.05，when compared with the control group；△P<0.05，when compared with cervical cancer group；●P<0.05，when comparison with the CINⅠ group.

2.3 多因素Logistic回归模型的建立

将HR-HPV DNA(X1)、IL-2(X2)、IL-4(X3)、IL-6(X4)、IL-10(X5)、IFN-γ(X6)、TNF-ɑ(X7)、TNF-ɑ/IL-10(X8)八项监测指标作为自变量，发生宫颈癌变作为因变量，采用向后-条件进行多因素Logistic回归分析，结果显示，IL-10、IFN-γ、TNF-ɑ、TNF-ɑ/IL-10为宫颈癌发生的影响因素，最终建立的回归方程Logit(P)=26.641+0.296X5-3.162X6-1.164X7-3.904X8(表2)。

表2 宫颈癌影响因素的多因素Logistic回归分析

2.4 评估Logistic回归模型

Hosmer-Lemeshow检验，P=1.000(P>0.05)，NagelkerkeR2=0.982，是修正的Cox&SnellR2决定系数，越接近1，拟合优度越好，提示模型拟合效果好。在已确诊为CIN的214例患者中，预测正确的有213人，错判的1人，正确率为99.5%；125例宫颈癌患者中，预测正确的有125人，错判0人，正确率为100.0%，总的正判率为99.7%。

3 讨论

肿瘤演进的各个阶段与其周围环境交互作用，由此形成的微环境是有别于人体正常内环境的肿瘤生长的“小环境”，肿瘤细胞转化由固有基因改变决定，其进展受肿瘤微环境、炎症和免疫应答的相互调控[9]。细胞因子是肿瘤细胞与微环境之间的信号传递分子，是介导炎-癌转化的关键因子[10-11]。

本实验结果显示，CINⅠ阶段即有各种作用机制相左的细胞因子异常表达，CINⅡ阶段各种细胞因子相互调控，作用彼此消长，虽有个别细胞因子如IL-2、IL-4、IL-6的过表达，但细胞因子网络仍维持基本平衡，CINⅢ阶段IL-10持续升高，TNF-ɑ/IL-10急剧下降，Th1/Th2明显失衡，Th2优势表达，促进CIN的进行性发展直至宫颈癌变。有研究报道[12]，血清细胞因子水平与HPV的持续感染无关，全身免疫可能不影响HPV感染的自然史，和本实验细胞因子在CIN和宫颈癌组存在差异的结果不一致，其中的差异在于标本来源不同所涉及的肿瘤微环境和HPV的空间分布特征。肿瘤微环境具有异质性，同一个体的不同部位，面对不同的微环境[13]，HPV感染不是全身的，局限于皮肤黏膜表皮细胞层，局部黏膜免疫系统是和全身免疫系统不同的另一个免疫体系，T细胞特异性识别病变局部的肿瘤抗原，分化为Th细胞，分泌细胞因子，发挥免疫效应功能，而在宫颈病变HPV感染以外的部位不直接接触抗原，无法快速启动免疫识别机制，无相应的免疫应答产生，HR-HPV感染在局部免疫功能中更具活性，宫颈局部细胞因子的表达水平较外周血更能尽早和准确地反映机体的免疫状态。

从本实验建立的预测宫颈癌变的回归模型看，具有共同特性和功能的细胞因子在宫颈癌变进程中所起的作用不同，IL-4破坏机体的免疫系统，促进肿瘤浸润和转移[14]，IL-2促进自然杀伤细胞的活性和细胞毒性T细胞的分化与增殖，IL-6发挥抗病毒抗细菌等生物学效应，但细胞因子来源广泛，可以是来源于肿瘤微环境中的免疫细胞也可是肿瘤细胞，不同的细胞因子对病毒抗原的反应状态不同，相互下调对方的生长分化，刺激自身增殖，同一细胞因子在肿瘤和感染免疫中具有双向调节功能，在病变的不同阶段作用不同，细胞因子网络的错综复杂掩盖了单个细胞因子在疾病发病机制中的作用。基于回归模型，IL-10在宫颈癌发生发展过程中的负向免疫抑制作用明显高于TNF-ɑ和IFN-γ的正向免疫保护作用，这可能是TNF-ɑ和IFN-γ清除病毒和调节癌性炎症反应功能受抑以及保护性细胞因子数量增加却不能消除体内肿瘤的原因，由此推测Th1细胞因子的持久过表达触发了宫颈病变的慢性炎症，这种慢性化过程在CINⅡ和CINⅠ阶段是缓慢发生渐进演变的，而在CINⅢ和宫颈癌阶段免疫反应虽活跃，但功能失调，Th1/Th2失衡，宫颈微环境免疫抑制加重，干扰机体对HPV清除的免疫调控，感染持续存在，打破了机体微环境抗瘤/促瘤的内在平衡，加剧CIN到宫颈癌的顺向发展，由此可见免疫抑制作用在整个炎-癌转化链条中的重要性，与文献报道宫颈癌的免疫状态为免疫耐受或免疫逃逸一致[15]。

本实验HR-HPV病毒载量未能进入最终的回归模型，提示病变进展到重度CIN和宫颈癌后，细胞的恶性转化可能不再依赖HR-HPV的高载量，这也佐证了HPV的致病机制是继发性免疫病理损伤而非直接溶细胞作用[16]，免疫抑制状态下有HPV拷贝数增加的可能性[17]。HR-HPV持续性感染是宫颈癌发生的触发因子，是必要非充分条件，HR-HPV病毒载量虽不能作为预测宫颈癌发生的量化指标，但有证据表明[18]，HPV慢性炎症作为协同或独立因素参与肿瘤的发生发展，结合本实验数据，高/超高的病毒载量仍有预警作用，可反映机体对病毒的清除能力。

综上所述，从CIN到宫颈癌，Th细胞因子的模式转变发生在CINⅢ阶段，通过对微环境的渐进性调节诱导炎-癌转化，Th2优势表达的免疫抑制微环境在宫颈癌进程中发挥关键作用。