不同益生菌中兽药黄荆子微生态制剂功效研究

■胡美忠 张新卓 郁建生

（铜仁职业技术学院，贵州铜仁554300）

随着人们生活水平提升，对绿色安全的动物性食品需求越来越大，安全无抗生素残留的动物性食品是将来畜牧业发展的必然趋势，发酵中兽药，把中药材和有益微生物有机结合起来，近年来在畜牧业中使用越来越多。发酵中兽药在发酵过程中，菌株代谢产生大量的纤维素酶、蛋白酶等酶制剂，破坏了中兽药的细胞壁，使中兽药的药效成分充分溶出，提高有效成分的浓度，同时菌株在发酵过程产生大量活性成分，对动物有利，有益活菌进入动物胃肠道后，能维持机体胃肠道内的微生态菌群的平衡等，调节动物机体整体功能，刺激免疫系统，产生益生素，产生消化酶等优良特性。故发酵中兽药有“中兽药、有益菌、酶制剂、益生素”四合一的特性，有望应用于畜牧业生产实现无抗养殖[1-3]。

中兽药发酵，发酵菌种是关键，中兽药是重点，两者正确的搭配才能发挥中兽药微生态制剂的特性。一般是选定可以利用发酵来提升药效的中兽药材，再选择正确的发酵菌种，发酵菌种根据国家规定的可直接饲用的微生物目录，有芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌和霉菌等。选择单菌发酵还是复合菌种发酵，以及复合菌种发酵各菌株之间的关系对最终微生态制剂的影响等需要深入研究，本实验以中兽药材黄荆子为例，探讨了几种益生菌发酵黄荆子的特性，以期得到适当的发酵中兽药黄荆子微生态制剂。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 黄荆子

2016年于铜仁市川硐镇农户手中收购。干燥、粉碎过60目筛备用，黄豆购于当地市场。

1.1.2 菌种、培养基和试剂

枯草芽孢杆菌（B.subtilis）S21、产朊假单丝酵母（C.utilis）M22、植物乳杆菌（L.plantarum）T3为本研究室分离筛选鉴定，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（ATCC 25923）。

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 L，pH值7.2。

YPD培养基：酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，水1 L，pH值自然。

MRS培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，吐温80 1 ml，磷酸氢二钾2 g，乙酸钠5 g，柠檬酸铵2 g，硫酸镁0.1 g，硫酸锰0.05 g，蒸馏水1 L，pH值（6.2±0.2）。

试剂：均为市售分析纯，酶活力检测所需的试剂根据文中标准所述配置。

1.1.3 主要仪器

垂直流超净工作台（ZHJH-C1214C，上海智城）；pH计（DELTA 320，上海闵胜）；恒温培养箱（BPH-9042，上海一恒）；高压灭菌锅（HVE-50，北方华粤）。

1.2 方法

1.2.1 黄荆子微生态制剂制备

固态培养基质配置：称取黄荆子85 g，黄豆粉7 g、葡萄糖5 g、尿素3 g，加入137.5 ml水搅拌均匀灭菌待用。

枯草芽孢杆菌（B.subtilis）S21、植物乳杆菌（L.plantarum）T3和产朊假单丝酵母（C.utilis）M22分别使用LB培养基、MRS培养基和YPD培养基活化，制备种子液。准备好的固态培养基质4份，第一份接种12.5 mlB.subtilisS21，第二份接种6 mlB.subtilis S21和6.5 mlC.utilisM22，第三份接种3 mlB.subtilisS21、6.5 mlC.utilisM22和3 mlL.plantarumT3，第四份加入12.5无菌蒸馏水，分别搅拌均匀，置于无菌烧杯（堆积厚度2～3 cm），烧杯口用无菌纱布蒙住，30℃下发酵72 h。

1.2.2 黄荆子微生态制剂抑菌活性

称取发酵好的黄荆子微生态制剂10 g，加入10 ml无菌水，震荡10 min后13 000×g离心得上清液，使用琼脂扩散法测试上清液对金黄色葡萄球菌（S.aureus）的抑制活性。

1.2.3 黄荆子微生态制剂活菌数

无菌称取发酵好的黄荆子微生态制剂1 g，加入9 ml无菌生理盐水稀释，震荡1 min后取1 ml按照上述方法继续稀释，得不同稀释度的样品，取10-9、10-10和10-11三个梯度样品涂布PCA平板，37℃培养36 h后计数。

1.2.4 黄荆子微生态制剂pH值

称取发酵好的黄荆子微生态制剂5 g，加入5 ml双蒸水，震荡5 min后13 000×g离心得上清液，使用pH计测试其pH值。

1.2.5 黄荆子微生态制剂黄酮含量

黄酮回归方程制作：精密称取10 mg芦丁（中检所），转入10 ml容量瓶，加入 60%乙醇超声辅助溶解，60%乙醇定容至10 ml，摇匀，得1 mg/ml芦丁母液。分别吸取芦丁母液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.8 ml于10 ml洁净容量瓶中，加入3 ml 60%乙醇、0.5 ml 5%NaNO2，混匀后静置6 min，再加入0.5 ml 10%Al(NO3)3，摇匀后静置6 min，加入3 ml 4%NaOH，60%的乙醇溶液定容至10 ml，摇匀，得到芦丁浓度梯度溶液。以不加芦丁母液的容量瓶为对照，分别测定各容量瓶中芦丁的OD500值，根据已知芦丁浓度和测定的OD500求其标准曲线。

称取发酵好的黄荆子微生态制剂5 g，加入5 ml蒸馏水，震荡10 min后13 000×g离心得上清液，取上清液1 ml加入9 ml蒸馏水，测定其OD500值 。根据回归方程换算黄荆子微生态制剂黄酮含量。

1.2.6 黄荆子微生态制剂蛋白酶活性

蛋白酶含量参考GB/T 23527—2009和SB/T10317—1999蛋白酶活力测定法测定。精确称取105℃烘干至恒重酪氨酸100 mg，逐步加入6 ml 1 mol/l盐酸溶解，后用0.2 mol/l盐酸定容至100 ml，取此液10 ml，以0.2 mol/l盐酸定容至100 ml，得100 μg/ml的酪氨酸溶液。以100 μg/ml的酪氨酸为母液，用蒸馏水分别配置0、20、40、60、80 μg/ml和100 μg/ml酪氨酸浓度梯度溶液，取6支试管分别吸取上述不同浓度酪氨酸1 ml，各加入0.4 mol碳酸钠5 ml，再各加入使用蒸馏水稀释2倍的福林试剂1 ml，摇匀置于水浴锅中，40℃保温发色20 min。分光光度计测定各管OD660值，将各管所测得的 OD660值减去0 μg/ml酪氨酸管的OD660值即得净OD660值。根据净OD660值和酪氨酸浓度求其标准曲线。

称取发酵好的黄荆子微生态制剂5 g，加入5 ml蒸馏水，在40℃水浴内间断搅拌1 h，9 000×g离心10 min，取上清液1 ml，加9 ml 0.1 mol磷酸盐缓冲液（pH值7.2）稀释。取1 ml样品液，置于40℃水浴2 min，加入经同样预热的酪蛋白1 ml，40℃水浴10 min后，立即加入0.4 mol三氯乙酸2 ml终止反应，8 000×g离心8 min得上清液，取1 ml上清液根据蛋白酶标准曲线制作方法所述的加入0.4 mol碳酸钠5 ml起，测定其OD660值，空白实验测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4 mol三氯乙酸2 ml使酶失活，再加酪蛋白。样品中1个蛋白酶活力定义为在40℃下1 min水解络蛋白产生1 μg酪氨酸，根据下述公式计算蛋白酶酶活。

式中：A——样品测定的OD660值，查标准曲线得相当的酪氨酸μg数；

N——酶液稀释倍数。

1.2.7 黄荆子微生态制剂脂肪酶活性

称取发酵好的黄荆子微生态制剂5 g，加入5 ml蒸馏水，震荡10 min后13 000×g离心得上清液样品，样品中脂肪酶活性根据脂肪酶测试盒（南京建成生物工程研究所）的说明进行测定。

企业价值共创体系的价值创造能力可分为基本价值创造能力和可持续价值创造能力两部分。前者对企业价值共创体系影响很大，是企业生存能力的综合体现，后者是企业价值共创体系的适应能力、协同感知能力、协同生产能力、未来竞争态势预测能力的综合体现。

1.2.8 黄荆子微生态制剂纤维素酶活性

纤维素酶活性根据NY/T 912—2004饲料添加剂纤维素酶活力的测定分光光度法测定。吸取乙酸-乙酸钠缓冲液（pH值5.5）4 ml，加入DNS试剂5 ml，沸水浴5 min，用自来水水浴冷却至室温，用蒸馏水定容至25 ml。得标准空白样。分别吸取精密配置的葡萄糖溶液（10 mg/ml）1、2、3、4、5、6 ml和7 ml，用乙酸-乙酸钠缓冲液定容至100 ml。配制成葡萄糖标准浓度梯度溶液。吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液2 ml，加入10 ml容量瓶中，再加入2 ml水和5 ml DNS试剂，电磁震荡3 s，沸水浴加热5 min，自来水水浴冷却，再用蒸馏水定容至25 ml。以标准空白样为对照，测定OD540值。根据OD540值和葡萄糖浓度求其标准曲线。

称取发酵好的黄荆子微生态制剂5.000 g，加20 ml乙酸-乙酸钠缓冲液（pH值5.5），震荡10 min用乙酸-乙酸钠缓冲液定容至100 ml，4℃下避光保藏24 h后摇匀，取30 ml离心机4 000×g离心，取上清液2.5 ml加乙酸-乙酸钠缓冲液定容至100 ml稀释得待测样品液。吸取2 ml样品液（先37℃水浴平衡10 min），加入到25 ml容量瓶中，再加入5 ml DNS试剂，超声3 s，然后加入2 ml羧甲基纤维素钠溶液（先37℃水浴平衡10 min），37℃水浴30 min，沸水浴加热5 min，用自来水水浴冷却至室温，加蒸馏水定容至25 ml，超声3 s，以标准空白样（吸取乙酸-乙酸钠缓冲液4 ml，加DNS试剂5 ml，沸水浴5 min，用自来水冷却至室温，用水定容至25 ml.制成标准空白样）为对照，在540 nm处测定吸光度AB。另吸取2 ml样品液（已经过37℃平衡10 min），加入到25 ml容量瓶中，加入2 ml羧甲基纤维素钠溶液（已经过37℃平衡10 min），超声3 s，37 ℃水浴30 min，再加入5 ml DNS试剂，超声3 s，以终止酶反应，沸水浴加热5 min，用自来水水浴冷却至室温，加蒸馏水定容至25 ml。超声3 s，以标准空白样（同测AB所述的标准空白样）为对照，在540 nm处测定吸光度AE。根据下述公式计算纤维素酶酶活。

式中：XD——纤维素酶活力（U/ml）；

AE——酶反应液吸光度；

AB——酶空白样吸光度；

K——标准曲线斜率；

M——等于180.2 g/mol；

t——酶解反应时间（min）；

D——稀释倍数。

1.2.9 黄荆子微生态制剂淀粉酶活性

称取发酵好的黄荆子微生态制剂5 g，加入5 ml蒸馏水，震荡10 min后13 000×g离心得上清液样品，样品中淀粉酶活性根据α-淀粉酶(AMS)测试盒（淀粉-碘比色法）（南京建成生物工程研究所）的说明进行测定。

2 结果与分析

2.1 黄荆子微生态制剂抑菌活性

不同益生菌发酵中兽药黄荆子所得的微生态制剂，其水提液表现出不同的抑制金黄色葡萄球菌活性（见图1）。由图1可知，不加有益菌发酵，没有抑菌活性，使用枯草芽孢杆菌S21发酵黄荆子，表现出强的抑制活性，使用枯草芽孢杆菌S21和产朊假单丝酵母M22混合发酵，抑菌活性强，但是使用枯草芽孢杆菌S21、植物乳杆菌T3和产朊假单丝酵母M22三种菌混合发酵，其抑菌活性轻微甚至不可辨。

图1 不同益生菌黄荆子微生态制剂抑菌活性

黄荆子微生态制剂表现出抑菌活性，其抑菌物质的来源可能有两个，在这两者的共同作用下起作用，第一个来源是有益微生物代谢产生的抑菌物质，前期的研究发现的枯草芽孢杆菌S21在会产生多种抗菌脂肽，第二个来源是黄荆子本身的药效成分有抑菌活性，但是没有经过长时间熬煮不会析出（空白对照组），在有益菌的代谢下，降解了黄荆子的细胞壁导致其药效成分析出，故显示了抑菌活性。使用枯草芽孢杆菌S21、植物乳杆菌T3和产朊假单丝酵母M22三种菌混合发酵，抑菌活性非常轻微，这可能是枯草芽孢杆菌S21和植物乳杆菌T3两者相互颉颃，一是影响枯草芽孢杆菌S21代谢产生抗菌物质，二是影响益生菌降解黄荆子细胞壁析出黄荆子抑菌成分，从而导致抑菌活性散失。说明在生产多菌种微生态制剂时，一定要注意发酵菌种之间的相互颉颃关系。

2.2 黄荆子微生态制剂活菌数和pH值

活菌数是衡量微生态制剂好坏的一个重要指标，pH值可以用来监测发酵过程[4,5]。试验的几种益生菌发酵黄荆子活菌数和pH值见表1，从表1可知，单独使用枯草芽孢杆菌S21发酵，使用枯草芽孢杆菌S21和产朊假单丝酵母M22二菌混合发酵或者枯草芽孢杆菌S21、植物乳杆菌T3和产朊假单丝酵母M22三种菌混合发酵，微生态制剂活菌数都达到1012。使用枯草芽孢杆菌S21作为发酵菌种或者枯草芽孢杆菌S21和产朊假单丝酵母M22混合发酵，与空白对照组相比其pH值会增加，而使用枯草芽孢杆菌S21、产朊假单丝酵母M22和植物乳杆菌T3混合发酵，与空白对照组相比其pH值略有下降，究其原因，应是植物乳杆菌T3代谢产生乳酸类物质，使pH值下降。

表1 不同有益菌黄荆子微生态制剂活菌数和pH值

2.3 黄荆子微生态制剂黄酮含量

发酵中兽药有利于中兽药的有效成分析出[6]。不同益生菌发酵中兽药黄荆子所得的微生态制剂，其黄酮含量变化见图2，由图2可知，使用枯草芽孢杆菌S21发酵，其黄酮含量比空白对照组高出约3倍，而使用枯草芽孢杆菌S21和产朊假单丝酵母M22二菌混合发酵或者枯草芽孢杆菌S21、植物乳杆菌T3和产朊假单丝酵母M22三种菌混合发酵，其黄酮含量相对于空白对照也提升1倍以上，可见发酵能使黄荆子黄酮从细胞内溶出。

黄酮是中兽药黄荆子的重要有效成分，但是黄酮存在于黄荆子细胞内，由于细胞壁和细胞膜的保护，黄酮从细胞内转移到细胞外比较困难，而通过发酵，有益菌的代谢会降解黄荆子细胞壁，有利于黄酮溶出，间接提升了药效。

图2 不同益生菌发酵黄荆子对黄荆子黄酮溶出的影响

2.4 黄荆子微生态制剂蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和淀粉酶活性

微生态制剂中各种消化酶能帮助动物消化，提高饲料中营养物质的利用率[7-8]。不同益生菌发酵中兽药黄荆子所得的微生态制剂的蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶和淀粉酶活性见表2。由表2可知，益生菌发酵黄荆子的微生态制剂，枯草芽孢杆菌S21单独发酵，其脂肪酶活性可达308.4 U/l，蛋白酶活力为51.46 U/mg，纤维素酶为 5.58 U/g，淀粉酶为104.17 U/dl，但是枯草芽孢杆菌S21和产朊假单丝酵母M22二菌混合发酵或者枯草芽孢杆菌S21、植物乳杆菌T3和产朊假单丝酵母M22三种菌混合发酵，在各种菌的相互作用下，各种酶的活力会有变化，有增加有降低。

表2 不同有益菌黄荆子微生态制剂酶活

3 讨论

中兽药发酵应用于动物生产是最近畜牧业的一个应用热点，发酵菌种的选择是中兽药发酵关键。发酵菌种原则上要满足安全性、稳定性、有效性以及生产实用性等要求。商业生产菌种应是国家批准的可直接用于饲喂动物的菌种目录。根据发酵菌的菌种数目可分为单一菌种制剂和复合菌种制剂两大类[9]，现在市场上的中兽药发酵产品基本上是复合菌种，常见复合菌种为芽孢杆菌、植物乳杆菌、酵母菌、嗜酸乳杆菌。

然而不同的益生菌混合发酵，因为益生菌之间有颉颃、共生等不同关系，必然会对最终的微生态制剂的效果产生巨大的影响。此研究中，使用枯草芽孢杆菌S21发酵，微生态产品表现为强的抑菌活性，但是使用枯草芽孢杆菌S21、植物乳杆菌T3和产朊假单丝酵母M22三种菌混合发酵，其抑菌活性轻微不可辨，在黄酮含量、各种消化酶的活力等方面，也有显著变化。可见，中兽药发酵菌种的选择，应该根据目标产品的预期功效来设计使用，建议优先选择单菌发酵，如果选择复合菌种发酵中兽药时，要注意不同菌种的相互作用，这样才能使发酵的中兽药功效最大化。

本项目研究结果显示，中兽药黄荆子发酵，单独选择枯草芽孢杆菌S21发酵，其功效综合起来比使用复合菌种发酵要好。