泸州枳壳挥发油的取提工艺优化

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1.泸州宇龙枳壳枳实研究院，四川 泸州 646000；2.西南医科大学药学院，四川 泸州 646000

枳壳是2015年版《中国药典》一部收录的常用中药，来源为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实。7月果皮尚绿时采收，自中部横切为两半，晒干或低温干燥。枳壳性苦、辛、酸、温，具有理气宽中、行滞消胀的功效，主治胸胁气滞，胀满疼痛，食积不化，痰饮内停；胃下垂，脱肛，子宫脱垂等病症[1]。枳壳的主要化学成分有为黄酮、挥发油和生物碱等。挥发油是枳壳理气、行滞、镇咳、祛痰、抑菌作用的重要成分，现已经鉴定出挥发油成分种类达100多种[2-3]。目前主要是对枳壳及其挥发油化学成分的研究报道较多，而对挥发油的提取工艺研究报道较少，故本试验采用水蒸气蒸馏法提取枳壳挥发油，优化挥发油的提取工艺，为枳壳挥发油的研究与开发利用提供依据。

1 仪器与材料

1.1 材料 枳壳(产地：四川泸州，批号20180206，四川天植中药股份有限公司)经西南医科大学税丕先教授鉴定为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL. 及其栽培变种的干燥未成熟果实，阴干，粉碎后，分别过药典1号筛(10目)、2号筛(24目)、3号筛(50目)，备用；水为纯净水。

1.2 仪器 YP15001型电子天平(常州市衡正电子仪器有限公司)，ZNHW型电热套(巩义市予华仪器有限责任公司)，DSY-9002型高速万能粉碎机(永康市九顺莹商贸有限公司)，水蒸气蒸馏装置(自行安装)，挥发油测定器，1、2、3、4号药典筛。

2 方法

2.1 提取方法 以水蒸气蒸馏法为提取方法提取枳壳中的挥发油。将粉碎细度、提取时间以及加水量作为考察因素，指标为挥发油的得率，按照2015版《中国药典》(四部)里面的通则“2204挥发油测定法”中的甲法提取[1]。分别精确称取粉碎细度不同的枳壳药粉各100g，放入1000mL圆底烧瓶中，加一定比例的水与若干粒沸石，用玻璃棒搅拌混合后，将圆底烧瓶置于电热套中，将挥发油测定器与回流冷凝管连接在圆底烧瓶上。自冷凝管上端加入一定量的水，当挥发油测定管充满水并有水溢入圆底烧瓶内时停止加水。将圆底烧瓶缓慢加热，直到圆底烧瓶中的液体沸腾，并保持一定时间的微沸状态，直到测定管中挥发油的量没有增加为止。之后停止加热并放置一小段时间之后，通过将挥发油测定器下端的活塞打开进行排水，保持排水速度较缓慢，直到挥发油的油层上端在0刻度线上5 mm处时停止排水。放置于室温条件下，等待挥发油冷却，冷却时间为1 h左右。开启活塞，使挥发油测定器中的下层液体缓慢排出，直到油层上端凹液面达到0刻度线，读出挥发油体积并记录数据，计算挥发油得率，计算公式如下[9]：

挥发油得率(%) =(V(mL)/M(g))×100% (V：挥发油体积 M：枳壳粉末的质量)

2.2 正交试验设计 因水蒸气蒸馏法装置简易、操作方便，并且能得到较为纯净的高质量挥发油。故此次正交试验采用该方法提取枳壳挥发油，测得挥发油提取率，并以此为检测指标，对挥发油的影响因素进行考察，考察的因素[10]包括：粉碎细度(A)、加水量(B)、提取时间(C)。将这3个影响因素作为三因素，设置三水平，进行L9(34)正交试验，确定挥发油的最佳提取条件。具体因素及水平见表1[11]。

表1 试验-因素水平表

3 结果

3.1 正交实验结果 取不同粉碎细度的药材，根据表2的设计进行正交试验，记录数据并对数据进行处理。由表2、3可知，对挥发油提取率影响较显著的因素为因素A，对于因素A，K1>K2>K3，由此选择水平1，即粉碎细度为过10目筛。因素B对挥发油得影响不显著性，对于因素B，K2>K1>K3，由此选择水平2，即加水量为8倍量。因素C对挥发油得影响不显著性，对于因素C，K2>K1>K3，由此选择水平2，即提取时间为7 h。所以在A1B2C2条件下，即使用过10目药典筛的枳壳粉末，加8倍量的水连续提取7h时，枳壳挥发油的提取率最高。

表2 正交试验设计表

表3 方差分析表

3.2 验证试验 精确称取过10目药典筛的枳壳粉末100g 3份，加8倍量的纯化水，水蒸气蒸馏7 h，利用所读取的挥发油体积，计算出挥发油得率如下：0.48%、0.50%、0.51%，平均得率约为0.50%，RSD为1.47%。结果说明，该挥发油提取方法有稳定性高和重复性好的优点。

4 讨论

4.1 实验方法的选择 枳壳为中医上常用的理气药，主要用于治疗食积不化，痰饮内停，胸胁气滞，胀满疼痛等。挥发油是枳壳三大有效成分之一。枳壳挥发油主要是由柠檬烯等芳香类化合物构成，此外，还含有其他单萜、倍半萜及其含氧衍生物等，共同构成了枳壳理气药效的物质基础。根据挥发油不溶于水、相对密度小于水等理化性质，因此，本实验选择水蒸气蒸馏法作为提取方法对枳壳挥发油进行提取。

4.2 粉碎细度对实验的影响 本文采用正交试验法，不仅优化了枳壳挥发油水蒸气蒸馏法的提取工艺，而且确定了提取工艺的最佳提取条件。实验数据表明，该提取方法有操作简单、安全可行以及重复性好等优点。由试验结果可知，在实验室使用电热套进行加热处理，对枳壳挥发油进行提取的试验中，影响枳壳挥发油提取率的关键因素是：枳壳粉末的粉碎细度，当枳壳粉碎度达到一定程度的时候，提取溶剂更容易进入枳壳的组织细胞间隙中间，从而使药材发生膨胀，以使细胞内外液的交换速度加快，而利于挥发油的提取[12]。

在实验过程中发现，保存在自封袋枳壳粉末样品，挥发油的提取率随存放时间的延长而降低，当枳壳粉碎后立即使用，其挥发油的提取率最大，在放置5 d后，挥发油的提取率大大降低。这可能是由于枳壳挥发油油室主要分布于果皮中[13]，粉碎后油室直接暴露于空气里，导致挥发油散失。所以建议提取挥发油时粉碎后立即使用。

此外，枳壳粉碎细度是影响枳壳挥发油质量的主要因素，然而2015年版《中国药典》通则2204中规定挥发油提取时粉末需过二号至三号筛，没有明确规定枳壳的粉碎度，为了对枳壳挥发油更好地提取和利用，建议选用过一号药典筛、而不能通过二号药典筛的粗粉进行枳壳挥发油的提取。

本次试验中，与文献报道相比较，挥发油的提取率较低，其原因可能是由于在使用粉碎机进行枳壳粉碎时，将果皮中的油室破坏了，致使油室直接暴露在空气中，加大了挥发油与空气的接触面积。另外打粉用时较长，并且在机器高速研磨过程中有大量的热量产生。这两个因素都会加快枳壳挥发油的损失。为了减少在打粉过程中挥发油的损失，可采用先将枳壳用水软化，然后在水中将枳壳捣碎，再将枳壳与水的混合物一起进行提取的的方法提取挥发油[14]。这样操作可以有效减少打粉时挥发油损失。

4.3 药材对实验的影响 新鲜枳壳带有大量水分，对于枳壳的销售、运输和储藏十分不便，故此新鲜枳壳必须在原产地进行干燥处理。干燥处理过程中常采用烘烤晾晒以及饮片生产所需的干燥处理，这些处理均会导致挥发油散失。并且在储藏过程中，若保存不当，挥发油也会有些许散失。因此可以采用枳壳与产地加工与炮制生产一体化工艺来减少挥发油的损失[15]。在提取时用新鲜枳壳切碎提取可避免因干燥、运输过程等因素造成的挥发油损失而使挥发油提取率降低。

4.4 糊化现象对实验的影响 在进行50目枳壳粉末、6倍加水量连续提取9 h的实验时，发生枳壳糊化的现象，而其他8组实验则未发生糊化的现象，可能有以下原因：①由于粉末过细，吸水能力过强，导致粉末不能与水混合均匀，使烧瓶下部的水过少，从而导致枳壳粉末糊化；②在整个提取过程中，因为粉末和水的混合物不均匀，加上提取温度过高，致使烧瓶底部局部温度过高，从而发生糊化。

为避免糊化现象发生，应该避免使用过细的粉末的进行提取，适当增加用水量，控制提取的温度。在提取过程中应该时刻注意观察挥发油的颜色，枳壳挥发油的正常颜色为淡黄色，发生糊化时，挥发油的颜色呈焦黄色。糊化发生时，应立即停止对装置加热，避免进一步糊化，而使挥发油的品质降低。

4.5 加水量对实验的影响 加水量对枳壳挥发油提取率的影响较小，但也有一定的影响，从实验结果中可以看出，8倍加水量可以提高枳壳挥发油的提取率。这可能是因为：①枳壳的吸水能力较强，加水量过少，只够枳壳吸水膨胀，不能产生足够的水蒸气，导致冷凝水减少，因此挥发油的提取率降低；②适量的水可以增加枳壳粉末之间的空隙，挥发油更易与水蒸气混合，使水蒸气更易将挥发油携带入冷凝器进行冷凝。

过量的水则会消耗较多的热量，不利于挥发油的提取，并且过量的水也是对水资源的浪费，在进行工业生产时，则会产生不必要的能源和资源的支出，增加企业的负担。因此，综合考虑，8倍量的水适合于挥发油的提取。

4.6 提取时间和浸泡时间对实验的影响 提取时间对挥发油的提取率几乎没有影响，但从实验结果可以看出，提取时间为5 h的挥发油得率明显低于提取时间为7 h和9 h，而提取时间为7 h和提取时间为9 h之间挥发油得率并没有明显差距，因此从节约成本上考虑，选用提取时间为7 h为佳。

干燥的枳壳遇水膨胀，通过一段浸泡时间，可以使水充分进入细胞间隙，但是在本实验中并未考虑浸泡时间对枳壳挥发油提取率的影响。这是因为已有的文献报道中报道过浸泡时间对挥发油的提取并不会产生影响，所以实验设计时没有考虑浸泡时间对挥发油提取率的影响。此外，通过在实验中的观察，枳壳的吸水能力十分迅速，在加热过程中就能完全膨胀，不需要额外的浸泡时间。

除了枳壳外，中药材中还有枳实、陈皮、青皮、核瓣的挥发油成分也与枳壳相似[16-17]，故本实验可以为含有相似成分的药用或食用植物的挥发油的提取方法等方面提供参考。

综上，根据正交实验结果和方差分析结果可以看出，所有影响因素中，对枳壳挥发油提取率影响最大的因素是粉碎细度，而对枳壳挥发油的提取率影响较小的影响因素是提取时间以及提取时加入的蒸馏水量，过10目药典筛的枳壳粉末的挥发油平均提取率高于过24目筛和50目筛的药材粉末；8倍加水量的挥发油平均提取率高于6倍、10倍加水量；提取时间为7 h的挥发油平均提取率高于提取时间为5 h和9 h。因此，本实验所得结论为：将枳壳粉末过10目筛，加入8倍量的水，连续提取7 h为枳壳挥发油的最佳提取工艺，此时枳壳挥发油的得率最高。