告达庭衍生物抑制人乳腺癌细胞增殖及其作用机制研究

1.衢州职业技术学院医学院，浙江 衢州 324000；2.浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315100

乳腺癌是全球女性中最常见的肿瘤之一，其发病率居女性肿瘤之首，现已经成为影响女性健康最主要的原因[1]。据统计，2012年全球乳腺癌新增病例数约有167万，占所有肿瘤的25%[2]。在中国女性当中，每年乳腺癌新增病例和死亡病例分别占到全世界的 12.2%和9.6%[3]，所以乳腺癌的诊断和治疗显得尤为重要。目前乳腺癌最常见的治疗手段为手术、放化疗、内分泌和靶向药物治疗，但是由于乳腺癌自身特点术后易引起复发且大多数药物会产生极大的副作用和耐药[4-5]，寻求新的、高效低毒的治疗乳腺癌的药物变得尤为重要。

中药在综合治疗癌症方面取得了良好的疗效，越来越受到相关研究者的关注[6]。白首乌为萝藦科鹅绒藤属植物耳叶牛皮消(Cynanchum auriculatum Royle ex Wight)的干燥块根，是传统的补益中药。中医理论认为，白首乌具有补肝肾、强筋骨、黑须发及延年益寿等功效，药理研究表明，白首乌具有抗衰老、抗炎、抗肿瘤、增强免疫、保肝等活性。白首乌的主要活性成分为C21甾体苷类化合物，许多研究表明其具有良好的抗肿瘤活性[7-10]。而告达庭(Caudatin)为C21甾体苷元，可从白首乌中分离得到。据研究报道，告达庭对人胃癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤均具有明显的抑制作用[11-13]。在生物体中告达庭主要以糖苷的形式存在，本研究在前人研究基础上，探讨告达庭衍生物，告达庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷(告达庭-3-O-β-D-吡喃磁麻糖苷，caudatin-3-O-β-D- cymaropyranoside)，对人乳腺癌细胞抗肿瘤活性及相关的作用机制。

1 仪器与材料

1.1 细胞株 人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 药物 告达庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷(Ca-G)自制，取耳叶牛皮消的块根，粉碎,80%乙醇溶液渗漉提取，减压浓缩成浸膏。加水混悬，用乙酸乙酯萃取，浓缩萃取液，进行硅胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇(体积比80∶1→5∶1)梯度洗脱，流分经硅胶柱色谱和HPLC制备，得Ca-G，纯度>98%，配制成10 mg/ml的母液，溶剂为DMSO，于-20 ℃分装保存。

1.3 试剂 胎牛血清、DMEM培养液购自美国Invitrogen公司；DMSO、MTT购自美国Sigma公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒，、PI/RNase细胞周期检测试剂盒、Annexin-V-FITC/7AAD细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天公司；anti-cyclin D1、anti-β-tubulin购自美国Cell Signaling Technology公司；horseradish peroxidase conjugated secondary antibodies (二抗)购自美国Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 细胞培养 人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，MCF-7培养于完全DMEM培养基中(含10%胎牛血清)，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养，细胞呈贴壁生长，密度达90%左右时进行传代。

2.2 MTT法测定细胞活力 收集对数生长期的MDA-MB-231，MCF-7细胞，经胰酶消化并离心后，调整细胞悬液浓度，以3×103个/孔的密度接种于96孔培养板，每孔100 μL。置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养24 h，待细胞贴壁完全后，加入不同浓度的Ca-G，浓度梯度设置为1、20、40、80 μg/mL，另外设置溶剂对照组(不加药，加入DMSO)和空白调零组(只加培养液、不加细胞和药物)，均设4个复孔，继续培养 48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，孵育4 h，吸净孔内液体，每孔加入150 μL的DMSO，震荡10 min，使蓝紫色结晶物甲瓒充分溶解，用酶标仪于570 nm处测各孔吸光度(OD)值，并计算相对细胞存活率。相对细胞存活率(%) =(给药孔-空白调零孔/对照孔-空白调零孔)×100%。

2.3 细胞周期 收集对数生长期的MDA-MB-231，MCF-7细胞，经胰酶消化并离心后，调整细胞悬液浓度，接种于6 cm的培养皿中，细胞密度为6×105个/皿，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。待细胞贴壁完全后，加入不同浓度的Ca-G(0、15、30 μg/mL)，培养箱中孵育48 h后，收集各组细胞，消化，离心，每组加入1 mL的PBS用来洗涤细胞，并用70%乙醇进行固定，置于-20 ℃过夜。取出固定好的细胞悬液用PBS洗涤细胞两次，按照PI/RNase细胞周期检测试剂盒说明书进行操作，每1×106个细胞沉淀中加入500 μL的PI/RNase染液，避光，染色15 min。染色完成后，上机检测实验结果采用flowjo软件进行分析处理。

2.4 细胞凋亡 收集对数生长期的MDA-MB-231，MCF-7细胞，接种于6 cm的培养皿中，细胞密度为6×105个/皿，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。待细胞贴壁完全后，加入不同浓度的Ca-G(0、15、30 μg/mL)，培养箱中孵育48 h后，收集各组细胞，经PBS洗涤后，按照Annexin-V-FITC/7AAD细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，每1×106个细胞沉淀中加入500 μL的PI/RNase染液，避光，染色15 min。染色完成后，上机检测实验结果采用flowjo软件进行分析处理。

2.5 Western blotting 收集对数生长期的MDA-MB-231，MCF-7细胞，经胰酶消化并离心后，调整细胞悬液浓度，接种于6 cm的培养皿中，细胞密度为6×105/皿，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。待细胞贴壁完全后，加入不同浓度的Ca-G(0、15、30 μg/mL)，培养箱中孵育48 h后，收集各组细胞。加入适量RIPA裂解液裂解。按照碧云天BCA蛋白含量测定试剂盒说明书检测样品蛋白含量，按BIO-RAD说明书方法配制分离胶，浓缩胶，上样，进行SDS-PAGE电泳、转膜，封闭，孵育一抗，过夜。并加入二抗，按照ECL显影液试剂盒说明书，放入化学发光成像系统，曝光。

3 结果

3.1 Ca-G对乳腺癌细胞活力的影响 MTT结果显示不同浓度的Ca-G给药48 h后，加药组乳腺癌细胞株的活力均明显降低，且呈一定的剂量依赖性(P<0.001)。如图1所示。

3.2 Ca-G对细胞周期的影响 由于Ca-G对MDA-MB-231，MCF-7细胞的生长具有显著的抑制作用，且细胞周期阻滞是影响细胞生长进程的关键因素之一。推测Ca-G可能对细胞周期具有调节作用，因此采用流式细胞术检测了Ca-G对细胞周期的影响。Ca-G作用MDA-MB-231，MCF-7细胞48 h后，G1期细胞数量显著增加，而 G2期细胞数目则减少，说明Ca-G可使乳腺癌细胞阻滞于细胞周期G1期。见图2、表1。

MDA-MB-231 MCF-7 Ca-G G1SG2G1SG20μg/mL47.52±0.7218.23±0.4634.25±0.2855.82±0.5426.23±0.3917.95±0.1615μg/mL58.46±1.08***25.58±0.9415.96±2.0063.31±1.00***21.86±0.8114.83±1.4530μg/mL62.92±0.30***24.25±0.5112.63±0.8175.13±0.60***12.52±0.4612.34±0.68

3.3 Ca-G对细胞周期关键蛋白表达水平的影响 cyclin D1可推动细胞周期由G1时期进入到S时期，在细胞周期G1期起到关键作用，所以本研究检测了cyclin D1蛋白表达。Ca-G能够明显下调乳腺癌细胞中cyclin D1的蛋白表达水平，说明Ca-G可能是通过抑制cyclin D1的表达引起乳腺癌细胞阻滞于细胞周期G1期。如图3所示。

3.4 Ca-G对细胞凋亡的影响 除细胞周期外，细胞凋亡也是抗肿瘤药物常见的作用机制之一。推测Ca-G可能对细胞凋亡具有调节作用，并采用流式细胞术检测了Ca-G对细胞凋亡的影响。Ca-G作用MDA-MB-231，MCF-7细胞48 h后，Ca-G呈剂量依赖性地引起MDA-MB-231，MCF-7细胞凋亡比例升高，在剂量为30 μg/ml时，凋亡比例分别为(MDA-MB-231)和(MCF-7)，说明Ca-G一定程度诱导乳腺癌细胞产生凋亡。见图4、表2。

表2 Ca-G对乳腺癌细胞凋亡的影响

MDA-MB-231 MCF-7 Ca-G正常细胞凋亡细胞死亡细胞正常细胞凋亡细胞死亡细胞0μg/mL98.94±0.760.71±0.340.35±0.5394.57±0.870.12±0.045.31±0.8715μg/mL91.75±1.277.74±0.95***0.51±0.7587.16±3.1212.31±2.80***0.53±0.4430μg/mL60.91±2.0337.41±1.33***1.68±0.7152.22±2.8645.78±1.96***2.00±0.97

3.5 Ca-G对细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响 研究表明caspase蛋白被激活是细胞凋亡产生的标志性事件。凋亡起始者caspase9/8被激活后，进一步激活下游凋亡执行蛋白如caspase3/7等，最终导致凋亡。本研究检测了Ca-G作用后caspase相关蛋白的变化，结果发现caspase 9, caspase 7表达升高。说明Ca-G诱导的乳腺癌细胞凋亡可能是通过激活caspase信号通路。如见图5所示。

4 讨论

中药因其不易产生耐药、毒副作用低等优点，在治疗癌症方面越来越受到研究者的青睐，许多用于临床的药物，如紫杉醇、羟基喜树碱等都是直接或间接来源于中药[14-16]。白首乌中C21甾体苷在体内外研究中，均具有良好的抑制肿瘤作用，告达庭作为其中一种苷元也起到一定抗肿瘤作用，但是其含量较低。告达庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷(Ca-G)是以告达庭为苷元形成的一种糖苷类化合物。很少报道其是否具有抗肿瘤作用。本研究通过MTT实验发现，Ca-G能够剂量依赖性地抑制乳腺癌细胞的增殖。

肿瘤细胞最常见的特点是迅速、无限增殖。细胞周期调控紊乱是肿瘤细胞异常增殖最常见且最基本的机制之一，为了检测Ca-G抑制乳腺癌细胞增殖是否和细胞周期的调控有关，本研究采用流式细胞术进行检测，结果发现，Ca-G作用后G0/G1期细胞数明显增多，说明Ca-G可诱导乳腺癌细胞阻滞于细胞周期G0/G1期。细胞周期是由大量细胞周期调控蛋白参与的复杂过程。其中cyclin D1是调控细胞周期G1期的关键蛋白，可通过结合并激活细胞周期蛋白依赖性激酶，促使G1期向S期的转变[17]。本研究结果表明，Ca-G能够抑制MDA-MB-231和MCF-7细胞内cyclin D1 的表达，可能与阻滞细胞周期G0/G1期相关。

细胞凋亡也是抗肿瘤药物常见的作用机制之一，为了检测Ca-G抑制乳腺癌细胞增殖是否和细胞凋亡有关，本研究采用流式细胞术进行检测，结果发现Ca-G作用乳腺癌细胞后，细胞凋亡比例明显升高。研究表明caspase蛋白被激活往往是细胞凋亡产生的标志性事件。文献报道，有两条经典的依赖caspase信号通路诱导细胞凋亡，分别是死亡受体介导的外源性途径和线粒体介导的内源性途径。无论是通过外源性或内源性途径，目的都是通过激活凋亡起始者caspase 9或caspase 8，进一步激活下游凋亡执行蛋白如caspase 3或caspase 7等，最终导致凋亡[18-19]。有文献报道在乳腺癌MCF-7细胞中不表达caspase 3[20]，所以本研究检测了caspase 7代替caspase 3。结果发现caspase 9、 caspase7表达均升高，说明Ca-G通过激活内外两条途径，激活caspase信号通路，导致三阴性乳腺癌细胞凋亡总之，告达庭-3-O-β-D-加拿大麻糖苷可有效抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7的增殖活性，其机制可能与细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡有关。这为告达庭及其衍生物抗肿瘤作用的进一步研究提供一定的实验基础，也为综合开发C21甾体苷类化合物的临床应用提供一种思路。