HPLC法测定藏药西藏棱子芹中阿魏酸的含量

1.重庆医科大学附属儿童医院，重庆 400014；2.重庆市中药研究院，重庆 400065

西藏棱子芹为常用藏药，习称藏当归，为伞形科(Umbelliferae) 棱子芹属(PleurospermumHoffm．) 植物，药用部位为根和根茎，有清热解毒的功效，用于治疗月经不调、消化不良等证[1]。收载于《中国藏药》[2]，在《西藏自治区藏药材标准》[3]第一册中只有薄层色谱定性鉴别，没有含量测定。本实验选用高效液相色谱法为西藏棱子芹中有效成分阿魏酸的含量测定建立了一种分离效率高、稳定性好、分析速度快的方法，为控制西藏棱子芹的质量提供了可靠的方法。经方法学考察，符合含量测定要求。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters e2965型 HPLC(美国沃特斯仪器有限公司)；KQ-3200B 型超声波清洗仪(巩义市予华仪器有限责任公司)。

1.2 材料 阿魏酸对照品(批号：110773-201614，中国食品药品检定研究院)；西藏棱子芹药材(批号：1703001、1704002、1709003，西藏甘露制药有限公司)经重庆市中药研究院生药室副主任药师舒抒鉴定为真品；色谱纯的甲醇，Ⅰ级水，分析纯试剂。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验 色谱条件：Waters C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)色谱柱；甲醇-1%冰乙酸(40∶60)为流动相；25℃柱温；318 nm检测波长[4]；1 mL/min流速；10 μL进样量。在此色谱条件下，阿魏酸与样品中其它组分分离良好，理论塔板数按阿魏酸色谱峰计大于4 000。HPLC色谱图如图1所示。

2.2 对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品，精密称取0.012 06 g于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得阿魏酸对照品贮备液。将阿魏酸对照品贮备液稀释10倍，即得阿魏酸对照品溶液的浓度为24.12 μg/mL。

2.3 样品溶液的制备 取西藏棱子芹药材，粉碎，过四号筛，取约2 g，精密称定，置于100 mL容量瓶中，加水适量，超声处理30 min，取出，放置过夜，用水定容至刻度，混匀，过滤，精密量取续滤液25 mL于分液漏斗中，加稀盐酸调节pH值至2，加乙醚20 mL，提取4次，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇溶解并定容至2 mL，即得样品溶液。

2.4 线性关系考察 取阿魏酸对照品溶液(24.12 μg/mL)，分别进样2、4、6、8、10、12 μL各2次，在上述色谱条件下测定峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，线性方程为Y=5 372 670.30X-56 939.91(r=0.999 9)。结果：阿魏酸进样量与峰面积呈良好线性关系的范围为0.048 24～0.289 4 μg。

2.5 精密度考察 取阿魏酸对照品溶液，进样量：10 μL；进样次数：6次，计算阿魏酸的平均峰面积，其RSD值为0.47%(n=6)，结果仪器精密度良好。

2.6 稳定性考察 取同一样品(批号201709003)，按样品溶液制备方法制备，照上述色谱条件，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，每隔2 h 进样1次，测定供试液12 h 的稳定性。其RSD值为0.52%。

2.7 重复性考察 取同一样品(批号201709003)6份，按样品溶液制备方方法制备,分别精密吸取10 μL，连续进样6次，测得RSD值为0.43%。

2.8 加样回收率考察 取样品(批号1709003，阿魏酸含量为0.121 0 mg/g)约1 g，精密称定，共9份，分别精密加入阿魏酸对照品溶液(0.241 2 mg/mL)0.4、0.5、0.6 mL各3份，按供试品溶液制备方法制成供试品溶液，按上述色谱条件测定峰面积，对加样回收率进行计算，平均回收率为98.06 %，其RSD值为1.25%(n=9)。见表1。

表1 阿魏酸加样回收率的考察

2.7 药材含量测定 取不同批号的西藏棱子芹药材约1.0 g，取西藏棱子芹药材粉(过四号筛)约1.0 g，精密称定，按样品溶液制备方法制得样品溶液，再按上述色谱条件测定峰面积，按外标法计算阿魏酸的含量。样品(批号：1703001、1704002、1709003) 中阿魏酸含量分别为0.179 5、0.168 3、0.121 0 mg/g。与文献报道[5]基本一致。

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择 阿魏酸溶于水、乙醇和乙酸乙酯，本试验将上述3种溶剂作为提取溶剂，同等溶剂用量，超声提取。结果水的提取效果好，故提取溶剂选用水。

3.2 提取方法的选择 对样品进行了加水超声提取和水浴加热回流提取考察，结果水浴加热回流提取与超声提取差别不大，但超声提取简便，故提取方法选用超声提取。

3.3 流动相的选择 本试验分别采用了甲醇-0.1%磷酸(50∶50)、甲醇-乙腈-1%冰乙酸(30∶20∶50)、甲醇-水(65∶35)、甲醇-1%冰乙酸(40∶60)和乙腈-水(42∶58)为流动相，结果表明样品中阿魏酸以甲醇-1%冰乙酸(40∶60)为流动相时分离度能达到要求。

3.4 检测波长的确定 阿魏酸的对照品溶液在波长200～600 nm进行紫外扫描，结果阿魏酸在318 nm处有最大吸收，故检测波长确定为318 nm。

西藏棱子芹主要含阿魏酸、甘草查尔酮甲、川陈皮素、异甘草素等化学成分，试验采用HPLC法测定阿魏酸含量，方法准确、简便，重现性好，可作为西藏棱子芹药材质量控制的有效方法。