白芨水提物对人肝癌HepG2细胞增殖的影响

遵义医学院药学院，贵州 遵义 563006

白芨是一种珍稀名贵中药材，为兰科植物白芨(Bletillastriata)的干燥块茎，其味苦、甘、涩，归肝、肺、胃经，具有收敛止血、消肿生肌等功效[1]，野生品主产于贵州、四川和湖南等地，已被列为国家濒危珍稀植物保护名录[2]。药理学研究表明，白芨具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌和促进伤口愈合等作用[3]。近年来，白芨在抗肿瘤方面时有报道[4-6]，其主要活性成分为大量含有的多糖类物质。

白芨中的主要化学成分有多糖类、菲类、联菲类、联苄类、甾体和三萜类等物质。菲类化合物是目前报道从白芨块茎中分离得到的较多的一类化学成分，该类化合物芳环上的取代基主要有羟基、甲氧基和对羟苄基，是白芨中的主要活性成分，联菲类化合物主要有白芨联菲A、B、C和白芨联菲醇A、B、C[7-9]。联苄类化合物是白芨中的另一大类化学成分，也是生物合成菲类化合物的前体物质。此外，白芨中还分离得到了较为特殊的C-31和C-32环菠萝蜜烷型三萜化合物[10]，C-32环菠萝蜜烷型三萜只在少数几种植物中被报道，两个1位氧苷的甾体皂苷据报道具有很好的抗肿瘤活性[11]。本研究对白芨进行水提醇沉提取白芨粗多糖，同时保留有机小分子物质部分，使用人肝癌HepG2细胞对其进行体外抗肿瘤活性实验，以期能为白芨的后续研究和临床应用提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 药材与细胞 白芨药材购买于遵义市百姓人大药房，经遵义医学院药学院生药学教研室吴发明博士鉴定为兰科植物白芨属白芨的干燥块茎。人肝癌HepG2细胞为本实验室细胞库冻存备用。

1.2 试剂 胎牛血清、DMEM/F12细胞培养基、胰蛋白酶和青霉素/链霉素溶液购买于美国Gibco公司；二甲基亚砜购买于美国Sigma公司；PBS缓冲液粉末购买于北京鼎国生物科技有限公司；CCK8试剂购于江苏碧云天生物科技有限公司；低熔点琼脂糖购买于北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚等均为国产分析纯试剂。

1.3 仪器 Heracell 240i二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；IX73倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)；Spectra max plus 384酶标仪(美国Molecular Devices公司)；SW-CJ-2FD超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；TD5M离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)；RE-2000A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

2 方法

2.1 白芨多糖的制备 取白芨药材粉末50 g，蒸馏水加热提取3次后，合并提取液，减压浓缩至粘稠，缓慢加入无水乙醇使体系乙醇终浓度达80%，4 ℃静置过夜，离心，分别收集沉淀和上清液。沉淀减压干燥即得白芨粗多糖，上清液减压浓缩得其他物质部分(主要为有机小分子物质)。经计算，1 g白芨药材可提取粗多糖0.368 g。用蒸馏水复溶粗多糖后，Sevage法除蛋白，再采用硫酸-苯酚法测得多糖含量为(72.45±6.01)%，4 ℃冰箱储存备用。

2.2 细胞存活率的测定 将生长状态良好的HepG2细胞接种于96孔板内，待细胞稳定贴壁后，分别给予不同浓度(10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL和160 μg/mL)的白芨多糖和有机小分子物质处理48 h后，各组加入CCK8试剂20 μL，37 ℃、5% CO2培养箱中孵育2 h后终止显色，并于450 nm检测波长测定其吸光度值。

2.3 细胞生长曲线的测定 将生长状态良好的HepG2细胞，以1 000个细胞/孔接种于96孔培养板中，待细胞稳定贴壁后，按分组情况进行处理，分别培养1、2、3、4、5、6、7 d。于每天定时取出培养板，每孔加入20 μL CCK8溶液，37 ℃、5% CO2培养箱继续培养2 h后取出，酶标仪450 nm处测定各孔吸光度值，以吸光度值表示细胞增殖能力大小，绘制生长曲线。

2.4 细胞形态的观察 将生长状态良好的HepG2细胞接种于6孔板内，待细胞稳定贴壁后，按分组情况进行处理48 h后，倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。

2.5 细胞克隆的形成 将生长状态良好的HepG2细胞使用胰蛋白酶消化，使之成为单细胞悬液，再用2×培养基(含20%的胎牛血清和2%的抗生素)调整细胞密度至1 000个细胞/mL待用。按1∶1比例使1.2%的琼脂糖和2×培养基混合，将混合液以1.5 mL/孔接种于6孔板中，室温放置30 min冷却凝固后，作底层琼脂置37 ℃ 5%CO2培养箱中备用。按1∶1比例使0.6%的琼脂糖和含有适当密度细胞悬液的2×培养基混合后，将混合液以1 mL/孔接种于铺有1.2%底层琼脂的6孔板中，形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37 ℃ 5%CO2培养箱中培养2～3周。待克隆形成后，将6孔板置于倒置显微镜，观察细胞克隆大小，并采集图像。

3 结果

3.1 白芨水提物对HepG2细胞存活率的影响 经不同浓度的白芨水提物作用48 h后，HepG2细胞存活率呈现下降趋势，并具有浓度效应关系。与对照组相比，多糖浓度为10 μg/mL时，存活细胞下降至90.96%；随着作用浓度升高，当提取物浓度达到20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL和160 μg/mL时，细胞的存活率分别为85.44%、60.85%、45.94%和33.04%，并均具有统计学意义(P<0.05)。此外，白芨水提物中的有机小分子物质部分对HepG2细胞的存活率显示出更好的抑制作用，当作用浓度为20 μg/mL，细胞的存活率则下降至69.91%。经计算，多糖和有机小分子物质作用HepG2细胞48 h的半数抑制浓度(IC50)分别为65.99 μg/mL和52.62 μg/mL。基于此，本研究选用25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL分别作为低、中和高浓度进一步研究白芨水提物对HepG2细胞增殖和细胞形态的影响。如图1所示。

3.2 白芨水提物对HepG2细胞生长曲线的影响 细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法，也是判定细胞活力的重要指标。对于贴壁细胞而言，细胞传代之后，经过短暂的悬浮后便会贴壁生长，随后度过长短不同的潜伏期，随即进入大量分裂的指数生长期。在进行药效学评价时，通过比较加药组与对照组之间肿瘤细胞在连续一段时间内的生长情况，从而判断肿瘤细胞在药物的作用下增殖情况是否受到影响。在对照组中，随着培养天数的延长，测得的OD值呈上升趋势，表示其孔中细胞数目在不断增多，细胞生长在持续进行。在经不同浓度的白芨水提物处理后，HepG2细胞的生长受到了明显抑制，其测定的OD值基本呈现下降趋势，作用时间越长，生长的细胞数目越少，提示白芨水提物在体外显著抑制了人肝癌HepG2细胞的增殖作用。如图2所示。

2.3 白芨水提物对HepG2细胞生长形态的影响 对照组细胞贴壁状态良好，形态正常，为不规则的梭形，且细胞周围未出现变亮区域。随着白芨水提物作用浓度的增大，细胞数目逐渐减少。低浓度处理的白芨水提物组(25 μg/mL)，大部分细胞仍然呈现正常形态，而使用中、高浓度的白芨水提物进行孵育后(50 μg/mL和100 μg/mL)，细胞形态发生明显改变，细胞松散，体积缩小，呈现固缩的圆形结构，且细胞周围变亮，细胞贴壁疏松，并有部分细胞漂浮。白芨水提物对人肝癌HepG2细胞形态的影响。如图3所示。

2.4 白芨水提物对HepG2细胞克隆形成的影响 软琼脂克隆形成实验(softagarassay)是肿瘤研究领域中一项重要的体外实验，将处理后的肿瘤细胞(单细胞悬液)接种于软琼脂中进行培养，每个有肿瘤特性的细胞就能形成一个克隆，通过观察克隆体积或计算克隆数量，从而了解肿瘤细胞的生长状况及增殖能力。经不同浓度的白芨水提物作用后，细胞克隆体积与对照组相比明显变小，说明白芨水提物对人肝癌细胞HepG2的生长增殖情况显现出显著的抑制作用。如图4所示。

4 讨论

中药治疗癌症具有多靶点、毒副作用小等特点，白芨作为我国传统中药，药用历史悠久，药用价值高。多糖作为白芨的主要活性物质，不但参与了细胞生命代谢，在机体免疫调节、损伤修复和抗肿瘤等方面均能发挥作用[12-13]。有研究报道，白芨多糖腹腔注射给药后，对小鼠子宫颈癌、小鼠艾氏腹水癌、实体型小鼠肝癌、肉瘤等均有抑制作用[14]。

虽然白芨中多糖含量较高，是其主要药效成分，但白芨中相对含量较低但活性较高的有机小分子组分是否也具有较好的抗肿瘤活性，且白芨中单体物质的抗肿瘤活性研究仍较少。因此，本研究对白芨进行水提醇沉制备白芨多糖，同时保留有机小分子物质部分，选用人肝癌HepG2细胞，研究其对HepG2细胞增殖的影响。结果显示，白芨水提物中的多糖和有机小分子物质均可抑制HepG2细胞的增殖作用。此外，白芨抗肿瘤活性的物质基础及深入的药理机制和动物体内实验也值得进一步研究与探讨。