纳米银洗液对皮肤刺激性与过敏反应试验研究

成都军区联勤部药品仪器检验所，四川 成都 610017

纳米银洗液由纳米银溶液1%(w/w)、十二烷基二甲基苄基溴化铵0.3%～0.6%(w/w)、甘油组成，具有具有消炎、杀菌、止痒作用，临床对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌等病原体微生物有明显抑制作用，用于烧烫伤创面感染及其他原因引起的创面感染。为了解该药经皮渗透对局部及全身产生的毒性反应和反应的恢复程度，根据国家食品药品监督管理总局关于发布药物安全药理学研究技术指导原则等 8 项技术指导原则的通告(2014年第4号)附件《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》，现对该药分别进行了家兔的皮肤刺激性试验以及豚鼠皮肤过敏性试验进行观察[1]，通过进行临床前毒理学评价，预测临床用药的安全性，为下一步的临床试验提供参考。

1 材料

1.1 动物 健康清洁级新西兰兔(2500±100)g，健康清洁级豚鼠(400%±50)g，雌雄各半。成都达硕实验动物有限公司提供；动物合格证号:SCXK(川)2013-24。将动物分笼饲养于空调实验室内，室温(24±2)℃，相对湿度40%～60%，人工控制昼夜各12h；供以标准鼠块料，自由饮水，每日换垫料一次；适应性喂养1周备用。

1.2 药物 纳米银洗液为亮黄色液体(批：20140701，成都军区联勤部药品仪器检验所研究)，4℃冰箱保存备用。2,4-二硝基氯苯(CDNB，批号：20120306，上海远慕生物科技有限公司)。

2 方法与结果

2.1 皮肤刺激性试验

2.1.1 方法 本试验采用同体自身对比法，试验前在家兔背部正中线两侧剪毛或剃毛(面积约3 cm×5 cm)，仔细检查皮肤，筛选皮肤完整无损的家兔4只，将受试样品均匀涂布于实验动物的左侧去毛区，并用油纸和两层纱布覆盖，再用无刺激性胶布或绷带加以固定，以保证受试样品和皮肤的密切接触，防止脱落和动物舔食实验样品。右侧去毛区均匀涂抹赋形剂，其余操作同左侧。涂布4 h后取下固定物和覆盖物，用温水或适当的溶剂洗去皮肤上残留的受试样品，观察局部皮损情况；4 h及8 h后重复上述操作。分别观察每只家兔给药后1 h、2 h、3 h、4 h、8 h、24 h及第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13及14天的皮肤刺激/腐蚀反应情况，并做好详细记录。第14天实验结束后，耳缘静脉空气栓塞处死家兔，肉眼观察家兔心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胰腺、胃、脾、前列腺、睾丸、卵巢、子宫等主要脏器有无明显病理改变，做好详细记录。参照国家食品药品监督管理局《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》中皮肤刺激性反应评分标准进行评分，并计算平均值，按“皮肤刺激性强度”评价标准进行评价。解剖取下左右两侧的皮肤，10%的中性甲醛固定，进行苏木精-伊红染色法染色，光镜下观察并做出检验报告。如图1～图8所示。

2.1.2 结果 涂药侧皮肤组未见明显红斑及水肿现象，涂药部位无色素沉着及出血点，极少数动物2 h后出现红斑，一般在48～72 h内消退。参照国家食品药品监督管理局《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》[应按《药物刺激性过敏性和溶血性研究技术指导原则》来评价，研究的是药物！]中皮肤刺激性反应评分标准进行评分，并计算平均值，按“皮肤刺激性强度”评价标准进行评价。结果见表1。

表1 纳米银洗液豚鼠皮肤刺激反应分值表

组别刺激反应平均分值1h2h48h72h4d7d10d14d刺激性评价样品组000.20.20000轻微刺激性阴性对照组00000000无刺激性

2.2 皮肤过敏试验

2.2.1 方法 试验前，在豚鼠背部正中线两侧剪毛或剃毛(面积约3 ×5 cm2)，仔细检查皮肤，筛选皮肤完整无损的豚鼠15只，按照体重性别随机分为3组：样品组、阴性对照组和阳性对照组，每组各5只。样品组将样品均匀涂布于实验动物的左侧去毛区，并用油纸和两层纱布覆盖，再用无刺激性胶布或绷带加以固定，以保证受试样品和皮肤的密切接触，防止脱落和动物舔食实验样品；阴性对照组左侧去毛区均匀赋形剂材料；阳性对照组左侧去毛区均匀涂布1%DNCB；其余操作均同样品组。4 h后取下固定物和覆盖物，用温水或适当的溶剂洗去皮肤上残留的受试样品，观察局部皮损情况；第7天及第14天重复上述操作。分别观察每只豚鼠给药后1 h、2 h、3 h、4 h、8 h、24 h及第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13及14天的皮肤刺激/腐蚀反应情况，并做好详细记录。第14天实验结束后，断头法处死豚鼠，肉眼观察豚鼠心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胰腺、胃、脾、前列腺、睾丸、卵巢、子宫等主要脏器有无明显病理改变，做好详细记录。参照国家食品药品监督管理局《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》中皮肤过敏反应程度的评分标准和皮肤致敏性评价标准进行评分和皮肤致敏性评价，同时观察动物是否有哮喘，站立不稳或休克等严重的全身性过敏反应。解剖取下左右两侧的皮肤，10%的中性甲醛固定，苏木精- 伊红染色法染色，光镜下观察并做出检验报告。如图9～图18所示。

2.2.2 结果 参照国家食品药品监督管理局《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》中皮肤过敏反应程度的评分标准和皮肤致敏性评价标准进行评分和皮肤致敏性评价 ,同时观察动物是否有哮喘 ,站立不稳或休克等严重的全身性过敏反应。结果见表2。样品组、阴性组动物在激发给药后的观察期内,皮肤反应正常，无红斑、水肿，致敏率为0%，按标准判定属于无致敏性物质，动物也无哮喘、站立不稳及休克等现象；各动物体质量增加明显；解剖肉眼观察各组织器官未见明显病理学改变；局部皮肤苏木精-伊红染色法染色无明显病理改变；阳性组动物在各规定时间点,均表现有明显红斑、水肿等过敏反应,反应率为100%，个别动物有哮喘现象，无证据表明与用药的相关性。

表2 纳米银洗液豚鼠过敏反应结果

组别平均反应值0h24h48h72h致敏率/%样品组00000阴性对照组00000阳性对照组2.65.84.02.2100

3 讨论

加强实验结果的分析(补充)。

本实验结果表明纳米银洗液的局部毒性小，对皮肤基本无刺激性和致敏作用,提示本品的应用安全性良好，符合皮肤用药的安全性要求，符合规范[2]要求。