通天草醇提物对阿尔茨海默病小鼠行为学及海马炎症介质的影响

仲丽丽 张维嘉 刘旭

[摘要] 目的 探討通天草醇提物对阿尔茨海默病小鼠学习能力、记忆能力、学习记忆保持能力等行为学及海马炎症介质白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子α（TNF-α）含量的影响。 方法 根据随机数字表法将48只雄性C57BL/6小鼠分为六组：模型组、正常组、多奈哌齐组和通天草醇提物高、中、低剂量组，每组8只。采用Aβ1-42（80 pmol/μL）双侧脑室注射的方法诱导阿尔茨海默病模型，各组实验开始每天灌胃1次，多奈哌齐组小鼠给予0.000 92 g/（kg·d）灌胃，通天草醇提物高、中、低剂量组小鼠分别给予3.96、1.98、0.99 g/（kg·d）灌胃，而正常组和模型组小鼠给予生理盐水灌胃，连续治疗35 d。采用Morris水迷宫检测阿尔茨海默病小鼠行为学的改变，酶联免疫吸附法检测阿尔茨海默病小鼠海马IL-1β、TNF-α含量。 结果 模型组小鼠的逃避潜伏期及游泳距离增加，同时伴有目标停留时间缩短和跨平台次数减少，寻找到水迷宫系统水下平台所需要的时间较长，与正常组比较，模型组小鼠行为学出现明显异常（P < 0.05）；与正常组比较，模型组海马炎症介质IL-1β、TNF-α水平明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；与模型组比较，通天草醇提物高、中剂量组小鼠行为学明显改善，海马IL-1β、TNF-α水平明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 通天草醇提物能够改善小鼠的学习能力和记忆障碍，降低炎性反应并缓解血脑屏障损伤，在阿尔茨海默病治疗中发挥重要作用。

[关键词] 通天草；阿尔茨海默病；行为学；炎症介质

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）09（a）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of alcohol extract of Waternut Herb on learning ability， memory ability， learning and memory retention ability of mice with Alzheimer disease， and the effects of interleukin （IL）-1β and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in hippocampal inflammation media. Methods Forty-eight male C57BL/6 mice were divided into six groups according to the random number table method： model group， normal group， Donepezil group， and high， medium， low dose of alcohol extract of Waternut Herb group， with 8 mice in each group. Alzheimer disease model was induced by bilateral intracere broventricular injection of Aβ1-42 （80 pmol/μL）. Each group of rats was given intragastric administration once a day. The mice in Donepezil group were given 0.000 92 g/（kg·d） by gavage. The mice in the high， medium， low dose of alcohol extract of Waternut Herb group were given 3.96， 1.98， 0.99 g/（kg·d） by gavage， respectively. While the mice in the normal group and model group were given intragastric administration with continuous saline， treatment for 35 days. The Morris water maze was used to detect the changes of behavior in Alzheimer disease mice. The levels of IL-1β and TNF-α in hippocampus of Alzheimer disease mice were determined by enzyme-linked immunosorbent assay. Results The incubation period and swimming distance of mice in the model group were increased. At the same time， the target residence time was shortened and the number of cross-platforms was reduced， it took a long time to find the underwater platform of the water maze system， compared with the normal group， the abnormal behavior in the model group was significantly increased （P < 0.05）. Compared with the normal group， the levels of IL-1β and TNF-α of the inflammatory mediators of the hippocampus in model group were significantly increased （P < 0.05）. Compared with the model group， the behavior of mice in the high and medium doses of alcohol extract of Waternut Herb group was significantly improved， and the levels of IL-1β and TNF-α in the hippocampus were significantly decreased， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Alcohol extract of Waternut Herb can improve the learning ability and memory impairment of mice， reduce the inflammatory response and relieve blood-brain barrier injury， and plays an important role in the treatment of Alzheimer disease.

[Key words] Waternut Herb； Alzheimer disease； Behavioristics； Inflammatory mediators

阿尔茨海默病是一种进行性的逐渐发展的神经变性疾病之一[1-2]，其特征为神经元外沉积β-淀粉样蛋白和神经元内Tau蛋白形成的神经原纤维缠结[3]。β-淀粉样蛋白积累后诱导小胶质细胞活化和促进炎症介质上调[4]，还能诱发学习记忆能力减退，引起行为学异常[5-6]。阿尔茨海默病神经血管假说证实，β-淀粉样蛋白产生和清除平衡破坏导致脑β-淀粉样蛋白水平增加引起血管毒性，神经性炎性反应是阿尔茨海默病发病的重要环节[7-8]，可见，阿尔茨海默病出现行为学异常与炎症介质异常是常见的。

据研究，通天草对阿尔茨海默病模型学习记忆[9]、形态学[10]、细胞凋亡[11]、NF-κB p65[12]、血脑屏障[13]、β-淀粉样蛋白前体蛋白[14]等有改善作用，对肝纤维化、抑郁模型小鼠行为具有改善作用[15-16]。本实验采用通天草醇提物，以Aβ1-42诱导阿尔茨海默病小鼠模型为研究对象，探讨通天草醇提物对阿尔茨海默病小鼠行为学和炎症介质的影响，期望为防治阿尔茨海默病奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级6月龄雄性C57BL/6小鼠68只，体重（22±2）g，购于黑龙江中医药大学动物中心[许可证号SCXK（黑）2013-012]，小鼠在常溫常湿设施环境内自由摄取食物且分笼饲养。

1.1.2 试剂 通天草醇提物由黑龙江中医药大学中药研究院提供；盐酸多奈哌齐（重庆植恩药业公司，批号：20141201）；肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、酶联免疫吸附试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：20140401）；Aβ1-42（北京博奥森公司，批号：bs-0107p）。

1.1.3 仪器 RT-雷杜酶标仪6100型（美国RT公司）；脑立体定位仪STW-1型（成都仪器制造厂）；台式全自动离心机TGL-16G型（上海安亭科学仪器厂）；Morris水迷宫系统ZH-DSG型（安徽淮北正华生物仪器公司）等。

1.2 方法

1.2.1 阿尔茨海默病模型 参考文献[17-23]制备阿尔茨海默病小鼠模型。各组小鼠用水合氯醛麻醉，将其固定，剃掉头顶上的毛露出颅骨，用脑立体定位仪定位海马，微量加样器一次性注入10 μg凝聚态Aβ1-42（80 pmol/μL）注进双侧脑室海马区，停留10 min缓慢退，骨蜡封闭，将其包扎，青霉素消炎预防感染；正常组给予等量生理盐水注射双侧脑室。实验造模前初始小鼠48只，造模后死亡5只，经过水迷宫系统筛查，优选40只学习记忆能力较差（60 s内不可寻找到Morris水迷宫系统第Ⅳ象限平台）小鼠为阿尔茨海默病模型。

1.2.2 分组与给药 按照随机数字表法将40只阿尔茨海默病小鼠模型分为模型组、多奈哌齐组和通天草醇提物高、中、低剂量组，每组8只，同时选择健康6月龄雄性C57BL/6小鼠8只为正常组。其中多奈哌齐组小鼠给予0.000 92 g/（kg·d）灌胃，通天草醇提物高、中、低剂量组小鼠分别给予3.96、1.98、0.99 g/（kg·d）灌胃，而正常组和模型组小鼠则给予生理盐水灌胃，各组给药35 d。

1.2.3 测定学习能力 灌胃结束后经过1 d休整期，参考文献[18，23]采用Morris水迷宫系统测定小鼠学习能力，水深20 cm，直径12 cm，（23±2）℃水温，平台放于水迷宫系统第Ⅳ象限，经过1～4 d训练后，各组小鼠学习能力不断提高，每次训练实践60 s，若60 s未找到平台，将小鼠放第Ⅳ象限平台15 s潜伏期为60 s，第5天使用水迷宫系统测定小鼠逃避潜伏期评价小鼠学习能力。

1.2.4 测定记忆能力 实验结束后过程同“1.2.3”，第5天撤去第Ⅳ象限平台，检测在60 s内小鼠找到水迷宫系统第Ⅳ象限平台的游泳距离，评价小鼠记忆能力。

1.2.5 测定学习记忆保持能力 实验结束后过程同“1.2.3”，在第5天撤去第Ⅳ象限平台，检测在60 s内小鼠在平台所在水迷宫系统第Ⅳ象限目标停留时间（游泳时间）和跨平台次数（跨越平台所在位置次数），用以学习记忆保持能力的评价。

1.2.6 测定海马炎症介质IL-1β、TNF-α含量 将实验小鼠断头处置放在冰袋上迅速取出海马，然后匀浆，放入离心机5000 r/min离心10 min，r = 5 cm，按组分装，-20℃保存样品。用RT-雷杜酶标仪6100型450 nm波长测定各孔组织吸光度（A），绘制标准曲线，按照方程测定IL-1β、TNF-α含量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析各组的数据结果，两两之间比较采用LSD-t检验，以P < 0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 通天草醇提物对阿尔茨海默病小鼠学习能力的影响

与正常组比较，模型组小鼠逃避潜伏期延长，差异有统计学意义（P < 0.05）；与模型组比较，多奈哌齐组和通天草醇提物高、中剂量组小鼠逃避潜伏期明显缩短，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2 通天草醇提物对阿尔茨海默病小鼠记忆能力的影响

与正常组比较，模型组小鼠游泳距离延长，差异有统计学意义（P < 0.05）；而与模型组比较，多奈哌齐组和通天草醇提物高、中剂量组小鼠游泳距离明显缩短，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.3 通天草醇提物对阿尔茨海默病小鼠学习记忆保持能力的影响

与正常组比较，模型组小鼠在目标停留时间明显缩短，跨跃平台次数也显著减少，差异有统计学意义（P < 0.05）；与模型组比较，多奈哌齐组和通天草醇提物高、中剂量组小鼠目标停留时间则明显延长，跨跃平台次数也明显提高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

2.4 通天草醇提物对阿尔茨海默病小鼠海马炎症介质的影响

与正常组比较，模型组小鼠海马IL-1β、TNF-α含量明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；与模型组比较，多奈哌齐组和通天草醇提物高、中剂量组小鼠IL-1β、TNF-α含量显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表4。

3 讨论

阿尔茨海默病初期会有学习记忆能力减退，脑组织有淀粉样物的沉积，其机体脑组织小胶质细胞吞噬β-淀粉样蛋白，随着β-淀粉样蛋白的产生而随之增加，小胶质细胞吞噬作用减弱，逐渐激活小胶质细胞的分泌能力，继而产生大量的炎症介质，反过来激活小胶质细胞和星形胶质细胞产生放大效应，促进β-淀粉样蛋白增加，进而加速阿尔茨海默病进程[24-27]。

本研究水迷宫实验显示，模型组小鼠的潜伏期及游泳距离增加，同时伴有目标停留时间缩短和跨平台次数减少，寻找到水迷宫系统水下平台所需要时间较长，说明模型组小鼠学习记忆能力减退，动物实验模型建立成功可用于后续实验。而经过通天草醇提物药物治疗后，高、中剂量组小鼠与模型组相比逃避潜伏期明显缩短，游泳距离减少，目标停留时间则明显延长，跨跃平臺次数也提高，可促使模型组小鼠较快地寻找到水迷宫水下平台，预示着通天草醇提物高、中剂量可以改善阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力，对其行为学具有改善作用。本研究还检测了阿尔茨海默病小鼠海马中炎症介质IL-1β、TNF-α的含量，结果显示，模型组小鼠海马IL-1β、TNF-α含量增加，而通天草醇提物治疗后，其高、中剂量可下调小鼠海马IL-1β、TNF-α含量，对小鼠学习记忆能力有改善作用，提示通天草醇提物高、中剂量可以改善小鼠的行为学，这可能与小鼠海马炎症介质IL-1β、TNF-α含量的降低有关。

综上所述，通天草醇提物能够改善小鼠学习能力和记忆障碍，降低炎性反应，并缓解血脑屏障损伤，以此在阿尔茨海默病治疗中发挥重要作用。

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（收稿日期：2018-03-09 本文编辑：张瑜杰）