脊髓灰质炎IgG抗体检测试剂参考品的制备及标定

谭振国 杨蓉 罗芳宇

[摘要] 目的 建立脊髓灰质炎IgG抗体检测试剂参考品，为脊髓灰质炎IgG抗体检测试剂盒的性能评价提供可靠的质控品。 方法 通过中和实验对血清进行确认，获得了符合要求的血清，每个型别参考品有22份样品，包含10份阳性参考品、10份阴性参考品、1份最低检出量参考品、1份精密性参考品。 结果 脊灰病毒IgG抗体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型阴性参考品符合率均不低于9/10，阳性参考品符合率均不低于8/10，精密性参考品变异系数均不高于15%，最低检出量参考品均不低于1∶8；参考品37℃放置5 d，反复冻融5次后稳定性良好。 结论 制备的脊髓灰质炎IgG抗体检测试剂参考品经各项试验检测结果合格，可用于脊髓灰质炎IgG抗体检测试剂的质控。

[关键词] 脊髓灰质炎IgG抗体；参考品；质量控制；标定

[中图分类号] R373.22 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）09（a）-0021-04

[Abstract] Objective Referance products were developed for assay kit of IgG of poliomyelitis to make it possible to reliably control quality of the assay kits in evaluating their properties. Methods Serum was confirmed through a neutralization test to obtain the serum which met requirements. Twenty-two samples were collected for each type of reference products， including 10 positive reference products， 10 negative ones， 1 reference product with the minimum detection limit and 1 precise reference product. Results The conformity ratio of type Ⅰ， Ⅱ and Ⅲ negative reference products of IgG of poliomyelitis was not below 9/10. The conformity ratio of positive reference products was not lower than 8/10， the coefficient of variation of precise reference was not higher than 15%， and the coefficient of variation of precise reference products was not lower than 1/8. The reference products were placed at 37℃ for 5 days. They were still quite stable after 5 repetitive freezing and thawing. Conclusion The prepared reference products of assay kit for IgG of poliomyelitis were tested to be qualified in all tests and could be used for quality control over such assay kits.

[Key words] Polio IgG antibody； Reference； Quality control； Characterization

脊髓灰質炎是由脊髓灰质炎病毒所造成的传染性极强的疾病，无特效治疗方法，但可通过疫苗预防。尽管20世纪50年代以来就有有效的脊灰疫苗，在20世纪80年代前，每年仍有>35万儿童因脊髓灰质炎而麻痹。因此世界卫生组织（WHO）1988年发起全球消灭脊髓灰质炎的倡议。到1999年，脊髓灰质炎病例已减少了99%，但全球仍未能实现消灭脊髓灰质炎的目标[1]。目前脊髓灰质炎病毒在巴基斯坦、阿富汗、尼日利亚和印度仍有传播[2-3]，使我国脊髓灰质炎野病毒（wild polio virus，WPV）输入性风险持续存在，2011年，我国新疆维吾尔自治区发生了由巴基斯坦输入的WPV引起的暴发疫情[4-7]。全球消灭脊髓灰质炎形势不容乐观，尤其是与我国相邻国家脊髓灰质炎疫情呈高发态势，我国发生WPV输入的风险增大[8-9]。随着WHO消灭脊髓灰质炎进程的实施，全球首剂Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗（IPV）在昆明生物所研制成功，IPV的生产已成为防控脊髓灰质炎感染流行、保持人群高免疫水平并最终消灭脊髓灰质炎的关键[10]。无论疫苗的效力实验，还是疫苗免疫效果评价都会进行抗体的检测，而脊髓灰质炎病毒抗体参考品的建立目前没有报道，因此，有必要建立脊髓灰质炎病毒IgG抗体参考品对脊髓灰质炎病毒IgG抗体检测试剂的质量进行规范。在此前提下，本实验室制备及标定了三套分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒抗体检测试剂的参考品，用于不同型别脊髓灰质炎病毒IgG抗体检测试剂的质控，现将结果报道如下：

1 材料与方法

1.1 参考品的组成

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型参考品均包含10份阳参、10份阴参、1份最低检出量参考品、1份精密性参考品。

1.2 试剂

本实验室制备的脊髓灰质炎IgG抗体检测试剂盒（批号：20170901）。

1.3 仪器

离心机，水浴锅，隔水式恒温培养箱，二氧化碳培养箱，酶标仪。

1.4 中和抗体实验

待测样品（1∶4稀释）经56℃灭活30 min后，加至96孔板中，50 μL/孔，作2倍系列稀释后，分别与100 CCID50的IPV病毒悬液于37℃中和2 h；加入（2～3）×105个/mL的Hep-2细胞悬液，100 μL/孔，置37℃、5%CO2培养箱中培养7 d。将能抑制50%细胞病变的最高稀释度定为IPV抗体的中和效价，并以稀释倍数的倒数表示。每次试验均设病毒回滴试验，回滴结果在32～320 CCID50/孔时，试验判为成立。以中和效价≥8判为中和抗体阳性。

1.5 酶联免疫吸附测定（ELISA）竞争法

标化参考品使用本实验室制备的脊髓灰质炎IgG抗体检测试剂盒（ELISA法）检测，最低检出量参考品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型均以1∶2、1∶4、1∶8及1∶16，在板上作2倍系列稀释；每型别阴参10份，每份1孔；阳参10孔，每份1孔；每型别精密性参考品1份，连加10孔。待测样品20 μL/孔，设阴性3孔、阳性2孔、空白1孔，各型待标参考品分别加入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型抗原检测板中，再分别加入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型IPV-HRP，90 μL/孔，37℃保温2 h；0.01 mol/L PBST洗板5次，TMB 37℃显色10 min终止反应。在450 nm波长处测量样品吸光度值（A值）。

1.6 稳定性试验

1.6.1 热稳定性试验 将3套参考品37℃放置3、5 d后（37℃放置1 d，取出检测）。

1.6.2 冻融试验 将3套参考品反复冻融3、5次后，取出检测。

2 结果

2.1 中和实验制备参考品

2.1.1 阳性参考品 经中和试验确认脊髓灰质炎病毒抗体阳性，人血清（HS）以每名患者的双份血清均可中和脊髓灰质炎病毒，HS抗体效价为1∶8～1∶256，选取高中低不同效价的HS制备成4份阳性参考品，因无法筛到单型别抗体阳性样品，故HS均为三价中和抗体阳性，抗体编号为HS1～HS4，3个型别阳参1～阳参4为相同效价血清；检测不同型别牛血清（CS）和兔血清（RS）的效价，稀释成高中低不同效价的6份阳性参考品，各型阳参编号见表1。各型别10份阳参2次中和实验检测均为阳性。

2.1.2 阴性参考品 经中和实验确认脊髓灰质炎病毒抗体阴性，HS以每名患者的双份血清均不能完全中和脊髓灰质炎病毒，抗体效價<1∶8，制备成6份阴性参考品，编号为HS5～HS10，各型前6份阴参均相同；选取其他型别的CS和RS作为4份阴性参考品，各型阴参编号见表2。各型别10份阴参2次中和实验检测均为阴性。

2.1.3 最低检出量参考品 各型中选取1份2次中和抗体为阳性的血清，经1∶2、1∶4、1∶8及1∶16倍比稀释作为最低检出限参考品。

2.1.4 精密性参考品 各型中选取1份2次中和抗体为阳性的血清稀释后作为精密性参考品。

2.2 ELISA法标定参考品

2.2.1 阳性参考品标定结果 使用3批次脊髓灰质炎病毒抗体检测试剂、9人次对10份阳性参考品进行检测，Ⅰ型阳性参考品符合率为94.4%，Ⅱ型阳性参考品符合率为90.0%，Ⅲ型阳性参考品符合率为97.8%。见表3。

2.2.2 阴性参考品标定结果 3批9人次对阴性参考品进行检测，10份阴性参考品符合率为100%。见表4。

2.2.3 最低检出量参考品标定结果 3批9人次对最低检出量参考品进行检测，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型最低检出量参考品9次检测值均在1∶8～1∶32。见表5。

2.2.4 精密性参考品标定结果 检测试剂的精密度用变异系数（CV）来衡量。在板上连加10孔精密性参考品，其CV=标准差（SD）/平均值（x）×100%。9人次检测结果显示（表6），Ⅰ型精密度参考品CV值在2.56%～8.14%之间，平均5.64%；Ⅱ型精密度参考品CV值在2.71%～9.24%之间，平均5.21%；Ⅲ型精密度参考品CV值在3.48%～11.24%之间，平均6.37%。各批次CV值均<15%，符合检测试剂对精密度的要求。

2.2.5 稳定性试验结果 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型待标参考品在37℃加速破坏试验或冻融试验后，实验结果见表7～9。各型参考品：10份阳参均>9/10，10份阴参均为阴性，精密性参考品的CV值均<15%，各型最低检出参考品均不低于1∶8。

3 讨论

生物制品中的标准物质是一种由不同时间、不用地点、不同条件、不同操作者得出相对一致性结果的工具。因此，标准物质作为生物制品生产检定中必不可少的重要组成部分，在生物制品质量控制和效力评价中发挥重要作用[11]。

诊断试剂参考品一般从灵敏性、特异性、精确性、稳定性四个方面进行考察[12]。使用阴阳性参考品对诊断试剂的特异性进行评价，本实验中的阳性参考品由脊髓灰质炎中和抗体阳性的血清组成，由于HS无法筛到仅单个型别抗体阳性的血清，因而3个型别的阳参1～4均为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型抗体均为阳性且效价不同的人血清HS1～HS4，其他6份阳参为本型别高中低不同效价的CS和RS组成。其目的在于高浓度的阳参用于防止抗体浓度过高引起前带效应的存在，而使检测出假阴性；低浓度的阳参是用于防止弱阳性样品漏检而设置。阴参由6份脊髓灰质炎病毒中和抗体阴性的HS1～HS6和其他型别抗体阳性的CS、RS组成，用于防止假阳性的检出和是否存在型间交叉。

标定出的最低检出量参考品的含量可对诊断试剂的灵敏度进行评价，在检测过程中可以监测试剂盒的检测下限是否符合要求。

根据国家药典对诊断试剂的要求，用于酶联诊断试剂的精密度（CV）应不高于15%（n = 10）[13]。本次标定的精密性参考品选取检中和抗体阳性、酶标检测A值在0.6～0.8之间的样品来控制检测试剂的孔间差。

稳定性是标准物质的特性量值随时间变化的性质，即在规定的时间间隔和环境条件下，标准物质的特性量值报纸在规定范围的性质[14]。考虑到参考品在保存、使用、运输过程中可能出现的情况，本研究设计了37℃加速破坏试验和冻融试验对参考品的稳定性进行考察。实验结果显示，37℃放置5 d或冻融3次仍可达到质控参考品的合格标准，通过分别使用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎IgG抗体检测试剂对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型抗体参考品进行检测，结果均符合参考品的质量要求。

脊髓灰质炎病毒IgG抗体的水平对脊髓灰质炎病毒的血清流行病学调查和疫苗的免疫效果评价具有重要意义[15]。检测脊髓灰质炎抗体的方法主要有经典的中和抗体实验和ELISA法。微量细胞病变法是肠道病毒中和抗体检测的“金标准”，在脊髓灰质炎病毒和EV71中和抗体检测中均得到普遍应用[16-20]，但此方法检测过程较繁琐，检测周期长，检测结果影响因素较多。用ELISA法检测抗体则操作简便，不需要特殊仪器，3～5 h即可出结果而更具有广泛的实用前景，但目前所报道的脊髓灰质炎抗体ELISA检测方法仅能检测单一种属的抗体，而脊髓灰质炎病毒的血清学调查检测的是HS，疫苗的效力实验检测是动物血清，制备脊髓灰质炎抗体也需要对动物血清进行检测，没有一种既能检测HS又能检测动物血清的脊髓灰质炎病毒IgG抗体检测方法。因此，制备出针相应的脊髓灰质炎病毒IgG抗体诊断试剂的参考品势在必行，脊髓灰质炎病毒抗体检测参考品的研制，可以为今后可检测不同种属的脊髓灰质炎病毒IgG抗体诊断试剂的研发及质量控制提供必要的保证。用中和抗体检测的方法制备出3套针对脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型抗体检测的参考品，并且在中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所（以下简称“我所”）制备脊髓灰质炎病毒IgG抗体检测试剂上进行标化，并确定了参考品的质量标准：阴性参考品符合率不低于9/10，阳性参考品符合率不低于8/10，精密性参考品变异系数不高于15%，最低检出量参考品不低于1∶8。

综上所述，由我所制备的脊髓灰质炎IgG抗体的3个型别的参考品是成功的，不仅可以对我所制备的脊髓灰质炎病毒IgG抗体诊断试剂质量控制起到重要作用，也为其他厂家研发检测不同种属的脊髓灰质炎病毒IgG抗体诊断试剂提供了必要的质量参考。

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（收稿日期：2018-02-06 本文编辑：张瑜杰）