艾灸对压力性损伤大鼠创面修复的影响

于杰 孙忠人 李洪玲

[摘要] 目的 觀察艾灸对压力性损伤大鼠创面修复的影响。 方法 采用自制模型装置通过缺血-再灌注损伤方式建立2～3期压力性损伤动物模型，将造模成功的70只SD雌性大鼠随机分为模型组与艾灸组，每组各35只。每组根据干预时间的长短再分为5个亚组，即1 d、3 d、5 d、7 d、10 d亚组，7只/亚组。将空白组35只正常健康大鼠随机分为上述5个亚组，7只/亚组，不予造模，仅对模拟造模部位处进行碘伏处理。模型组于造模后只对创面进行碘伏常规处理，艾灸组在造模成功后，先对创面予碘伏处理，继予艾灸回旋灸操作，以压力性损伤创面为中心，1 cm长度为半径，1次/d，15 min/次。依次在上述5个时间点标本采集前测定压力性损伤创面面积，通过苏木精-伊红（HE）染色法观察其创面组织的病理形态学变化。 结果 治疗1 d后，各组组间的压力性损伤创面愈合率差异无统计学意义（P > 0.05）。艾灸组在其余4个时间点创面愈合率均明显高于模型组，分别对同一时间点进行两组组间比较，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。与模型组比较，艾灸组创面肉芽组织分别在生长状态与出现时间方面存在明显优势，其创面面积缩小程度较为明显，收缩速度更快。HE染色发现，艾灸组大鼠创面组织中的炎细胞浸润高峰及肉芽组织出现时限均较模型组提前，成纤维细胞增生程度与数量更明显，且出现时限较早。艾灸组大鼠创面更早出现新生血管和表皮结构的恢复。 结论 艾灸能够有效促进压力性损伤创面的愈合。

[关键词] 艾灸；压力性损伤；修复；创面愈合率；病理形态学

[中图分类号] R245.81 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）09（a）-0004-06

[Abstract] Objective To observe the effect of moxibustion on wound repair in rats with pressure injuries. Methods The models of rats with pressure ulcers which belonged to stage 2-3 were established by using self-made devices of pressure ulcers. The models of 70 SD female rats with skin ischemia reperfusion injury were randomly divided into model group and moxibustion group. There were 35 rats in each group. Each group was divided into 5 subgroups including 1 d， 3 d， 5 d， 7 d and 10 d according to the length of intervention time. Seven experimental rats were included in each subgroup. The blank group was given shaving disinfection， tied together with other groups of rats given only conventional iodophor intervention. The model group was only given conventional iodophor intervention. The moxibustion group was given iodophor intervention at first and direct moxibustion intervention to the local tissue of pressure ulcer with cyclotron operation， with moxibustion once a day and 15 minutes each time. The wound area was measured respectively after five time-points （1 d， 3 d， 5 d， 7 d and 10 d after intervention or treatment） before drawing. HE staining was used to observe the pathological changes of the pressure ulcer. Results There were no significant differences in the wound healing rates between the groups in the 1 d after intervention（P > 0.05）. Compared with the model group， the wound healing rates of moxibustion group were significantly higher at the four time-points including 3 d， 5 d， 7 d and 10 d after treatment. At the same time-points， there were significant differences between the two groups （P < 0.01）. Compared with the model group， the granulation tissues in the wounds of rats which belonged to moxibustion group with pressure ulcers had obvious advantages both in the time-points and the growth states. There were granulation tissues at the third day after treatment in the moxibustion group， while those of model group appeared about at the seventh day after iodophor intervention. Simultaneously， the wound contraction rates of pressure ulcers were faster in the moxibustion group which had more evident area reductions. Pathological changes of pressure ulcers were observed by HE staining that the peaks of the inflammatory infiltrations which existed in the moxibustion group had appeared in advance compared with the model group. Meanwhile， fibroblasts appeared earlier， having more numbers and obvious degrees of hyperplasia. The occurrence time of granulation tissues was earlier in the moxibustion group. Hence， neovascularization which belonged to moxibustion group formed earlier than that of model group. The epidermal structures of rats in the moxibustion group recovered in advance. Conclusion Moxibustion can promote the wound healing effectively in rats with pressure injuries.

[Key words] Moxibustion； Pressure injury； Repair； Wound healing rate； Pathological morphology

压力性损伤是一种由于局部组织长期受压，继而发生持续缺血、缺氧以及营养不良，最终致使组织发生溃烂、坏死的外科疾患。本病的发病因素众多，主要包括三大类，即内源性因素、外源性因素与加剧性因素，其中多因素相互作用导致发病居多[1]。剪切力、摩擦力与垂直压力共同构成压力性损伤的外源性因素，上述三大力学因素在致病过程中或单独或合并导致本病的发生[2-3]。营养、感觉障碍、年龄、意识水平、活动性等共同构成了压力性损伤的内源性因素[3]。本研究动物模型评价参照NPUAP公布的最新指南（2016版）[4]，其分期严格按照该指南的最新界定标准。本课题组多年来致力于艾灸促进压力性损伤组织血管新生的相关研究[5-12]，且采用艾灸治疗压力性损伤取得较满意的临床疗效。本研究通过KP-21C型求积仪测定压力性损伤创面愈合率、肉眼及苏木精-伊红染色（HE染色）观察创面组织病理形态学变化，旨在客观评价艾灸对压力性损伤大鼠创面修复的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

对120只体重230～245 g的雌性健康SD大鼠[黑龙江中医药大学动物实验中心，实验动物合格证：SYXK（黑）2013-012]给予单笼喂养，使其自由饮水、进食并活动[6-9]。在湿度40%～50%RH、温度（19.0±2.1）℃、明暗周期12 h的环境中进行适应性喂养14 d后选取85只给予造模处理，另35只作为空白组，对实验动物的处置符合动物实验伦理标准。

1.2 主要仪器及试剂

1.2.1 主要仪器 求积仪（KP-21C型、日本PLACOM），电子天平（MP200A型、上海精密仪器厂），造模装置（玻璃板、纯净水瓶、十字形托盘、不锈钢丝网、胶水、膨胀螺丝、帆布条、钢珠、尼龙扎带），电动理发器（宁波真汉子电器有限公司），非接触式电子温度计（广州市金鑫宝电子有限公司）。DM4000B显微镜、EG1169组织包埋机及RM2235型切片机（德国LEICA），HI1220烘片机（德国LEICA），包埋盒（世泰实验耗材有限公司）。

1.2.2 试剂 敏感肌肤型脱毛膏（薇婷牌，利洁时家化中国有限公司），五年陈艾（有烟艾条，规格：18 mm×200 mm，南阳药益宝艾草制品有限公司），医用酒精（安捷高科消毒制品有限公司），医用碘伏（山东利尔康消毒科技有限公司）、医用棉签（沈阳北华医材有限公司），生理盐水（青岛华仁药业股份有限公司）。水溶性伊红（碧云天生物技术），苏木精染液（碧云天生物技术），无水乙醇（上海富宇），二甲苯（上海富宇），石蜡、10%中性甲醛溶液、盐酸（均为上海富宇），蒸馏水[屈臣氏集团（香港）有限公司]，定性滤纸1001-6508（美国GEwhatman），水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司）。

1.3 自制装置

①取3块玻璃板（规格：6.0 cm×5.0 cm×1.5 cm）制成倒置的“U”形装置，于水平玻璃板中心打孔，孔径大小=膨胀螺丝外管外径。②处理固定膨胀螺丝外管，确保螺钉锥度侧冲下方从铁管中穿行。③固定水瓶底座与螺纹。④调节螺丝外管高度后固定铁管与水平玻璃板，系牢帆布条[7-9]。

1.4 模型制备

分别用塑料制尼龙扎带将大鼠4个部位固定（腹部、双侧腋下、双侧踝部、双侧腹股沟内侧），充分暴露造模部位后备皮处理（备皮长宽分别20 mm），消毒待造模处及螺钉锥度侧。将造模装置固定于大鼠腿部近膝关节骨隆突处（即造模处），通过缺血-再灌注损伤循环周期模式制备压力性损伤动物模型。1个循环=缺血期（120 min）+再灌注期（30 min），5个循环/d，持续3 d。30 min的再灌注期解压松绑大鼠，任其活动、饮水及进食。造模3 d后，持续1 d的观察期，用以评价模型制备成功与否，并剔除制备失败的动物模型[7-9]。

1.5 动物模型的评价

动物模型的评价参照2～3期压力性损伤（即2016年NPUAP公布的最新指南）[4]，并进行肉眼（创面颜色、形态及渗出物性质）及行为学（大鼠整体状态、性情、步态及二便等）观察[13]。

1.6 实验分组及干预治疗

遵循先造模后随机的原则，将85只实验大鼠进行压力性损伤缺血-再灌注模型制备，造模过程中共9只大鼠死亡，6只大鼠造模失败。将造模成功的70只雌性SD大鼠采用随机数字表法随机分为模型组和艾灸组，每组各35只。每组根据干预时间的长短再分为5个亚组，即1 d、3 d、5 d、7 d、10 d亚组，7只/亚组，造模后至干预过程中共有10只大鼠脱落。将空白组35只正常健康大鼠随机分为上述5个亚组，7只/亚组，其中共有5只大鼠于备皮时出现负损伤而给予剔除，因此上述所有亚组最终每亚组6只大鼠纳入实验。三组动物捆绑方式均相同，即对大鼠腹部、双侧腋下、双侧踝部、双侧腹股沟内侧4个部位通过塑料制尼龙扎带捆绑固定于不銹钢丝网上。空白组不予造模，仅对模拟造模部位处进行碘伏处理。模型组于造模后只对创面进行碘伏常规处理，艾灸组在造模成功后，先对创面予碘伏处理，继予艾灸回旋灸操作，以压力性损伤创面为中心，1 cm长度为半径，1次/d，15 min/次。将艾条燃烧端及非接触式电子温度仪探头与压力性损伤创面的距离控制在30 mm左右，将艾灸温度控制在40～42℃，测量温度每隔30 s测1次，全程施灸操作需注意对艾条燃烧过程中产生灰烬的及时处理，旨在达到艾灸疗效最佳化与负损伤最小化。

1.7 测定压力性损伤大鼠创面愈合率

对各组大鼠分别选取两个测量点（即造模后和取材前）进行创面面积的测定。首先，采用制版硫酸转印纸（消毒后）通过透绘法对压力性损伤创面处勾画轮廓图，将其扫描至计算机，然后对其等比例放大10倍后打印，利用KP-21C型求积仪测定经放大10倍后的图形面积，再将测定面积值除以10倍，得出大鼠压力性损伤创面实际面积值，最后分别测量3次取均值作为实验大鼠压力性损伤创面面积值。压力性损伤大鼠创面愈合率=[（造模成功后的测量面积-取材前的测量面积）/造模成功后的测量面积]×100%。

1.8 观察艾灸对实验大鼠压力性损伤创面组织的病理形态学改变的影响

1.8.1 标本采集 分别将模型组和艾灸组大鼠于治疗1 d、3 d、5 d、7 d、10 d后进行标本采集，空白组大鼠随同以上两组于上述5个时间点取材处理。标本采集前对所有大鼠体重测定，根据体重不同分别给予对应的水合氯醛进行腹腔注射麻醉，取材区域为以压力性损伤创面正中心为圆点，5 mm为半径的皮肤全层组织。取材过程中注意勿将组织打卷，展平固定在滤纸中，置于包埋盒中，贮存在盛有10%的中性甲醛溶液，24 h内做包埋处理，标本采集后的所有大鼠脱颈椎处死。

1.8.2 包埋及HE染色步骤 包埋：采集后的标本置入已标号的新包埋盒。60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ，依次进行酒精梯度脱水。酒精和二甲苯等量混合及二甲苯浸泡，透明处理。在二甲苯和石蜡等量混合、石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ进行浸蜡处理，包埋成块。HE染色：①切片≤4 μm。②常规二甲苯脱蜡处理切片，梯度酒精脱水处理：二甲苯Ⅰ 5 min → 二甲苯Ⅱ 10 min → 无水乙醇Ⅰ 2 min → 无水乙醇Ⅱ 2 min → 95%乙醇1 min → 80%乙醇1 min → 75%乙醇1 min。③蒸馏水冲洗1 min。④苏木精染色5 min → 冲洗。⑤将1%盐酸乙醇分化30 s。⑥蒸馏水过洗60 s。⑦伊红液染色2 min → 冲洗30 s。⑧常规脱水、透明处理：95%乙醇Ⅰ浸泡1 min → 95%乙醇Ⅱ 1 min → 无水乙醇Ⅰ 3 min → 无水乙醇Ⅱ浸泡3 min → 二甲苯Ⅰ 3 min → 二甲苯Ⅱ浸泡3 min。⑨封片：中性树胶封片。⑩光学显微镜下观察大鼠压力性损伤皮肤的病理形态学改变。

1.9 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较选取ANOVA，多重比较选取LSD检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察艾灸对压力性损伤大鼠损伤修复中创面愈合率的影响

观察各组大鼠在不同时间点压力性损伤创面愈合率的比较发现，治疗1 d后，模型组和艾灸组两组创面愈合率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。与模型组比较，艾灸组在治疗3 d、5 d、7 d、10 d后的创面愈合率明显升高。分别对同一时间点进行两组组间比较，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

2.2 实验大鼠压力性损伤创面局部的肉眼观察改变

空白组大鼠为正常皮肤组织，皮肤完整，外观呈肉粉色，未见水肿及渗出等损伤，见图1A。造模前期，大鼠创面颜色变红，压之不褪色，皮肤较完整，符合1期压力性损伤的模型标准；造模后期，大鼠病灶创面伴有结痂，质地或软或硬，或偏创面中央，或于创面周围，部分水疱破裂浆液得以吸收，部分水疱仍然存在，创面仍表现水肿，颜色红紫，符合2～3期压力性损伤的特点；造模结束第1天晚即造模观察评价期，大鼠的创面水肿，颜色或红紫或苍白，血性或黄色渗出物，符合2～3期压力性损伤特点，即造模成功标志。见图1B～D。

模型组大鼠在上述5个时间点经过碘伏处理后，创面愈合进程较艾灸组明显滞后，但整体趋势向愈合发展。碘伏处理3 d后，创面呈结痂状态，质硬，脓性渗出物减少，血性渗出物仍存在，水肿明显。碘伏处理7 d后，创面轮廓缩小明显，结痂质地较前更软，部分逐渐脱落，创面呈现粉红色，肉芽组织较丰富。见图2A～B。

艾灸组治疗3 d后，其创面渗出物（血性）明显减少，创面颜色呈鲜红色，边缘结痂，呈现柔软的肉芽组织，水肿明显缓解。治疗5 d后，压力性损伤创面渗出物显著减少，较干燥，肉芽组织较3 d明显丰富，创面颜色呈粉红色，结痂质软，尤其在创面边缘处的结痂部分已与皮肤分离，创面面积缩小显著。治疗10 d后，创面颜色呈现皮肤本色或略白色。见图3A～C。

2.3 HE染色观察大鼠压力性损伤创面组织的病理形态学改变

空白组镜下清晰可见较完整的表皮全层结构，真皮层可见丰富的胶原纤维，见图4A。模型组碘伏处理1 d后，镜下所示真皮层内大量出血，以及少量的中性粒细胞浸润，纤维组织断裂及坏死。碘伏处理3 d后，表皮层断裂，真皮层出现大量中性粒细胞浸润，伴有出血。碘伏处理5 d后，真皮层可见大量的中性粒细胞浸润，少许血管坏死及纤维增生。碘伏处理7 d后，损伤部位可见少量的胶原细胞增生，大量的成纤维细胞增生及毛细血管芽。碘伏处理10 d后，镜下可见少量的中性粒细胞和淋巴细胞浸润、大量的胶原细胞、成纤维细胞增生。见图4B～D。

艾灸组治疗1 d后，镜下所示部分表皮细胞呈脱落状态，真皮层可见大量中性粒细胞浸润。治疗3 d后，真皮层出现小血管坏死，大量的中性粒细胞浸润，出现少许毛细血管芽。治疗5 d后，表皮的角质层、颗粒层清晰可见，其真皮层可见少许中性粒细胞浸润，以及大量成纤维细胞为主的增生，毛细血管芽较3 d后明显增多。治疗7 d后，表皮层恢复程度尚可，真皮层可见少许炎细胞的浸润及大量的成纤维细胞增生。治疗10 d后，表皮结构恢复较好，伤口缩小明显，可见毛囊细胞的增生，真皮层少许的成纤维组织增生伴有大量的胶原纤维，肉芽组织较前减少。见图5A～C。

3 讨论

压力性损伤与中医學的“褥疮”、“席疮”或“压疮”病名对应。中医学对席疮的认识早在《外科启玄》中便有记载，即“席疮乃久病著床之人，挨擦磨破而成。上而背脊，下而尾闾，当用马屁勃软衬……病人但见席疮，死之征也。”它不仅首次提出“席疮”的概念，并在病因病机、发病部位及干预措施等方面加以概括。《灵枢·官能》：“针所不为，灸之所宜。”《医学入门·针灸》载：“药之不及，针之不到，必须灸之。”回旋灸属于悬起灸的范畴，对于压力性损伤、皮肤浅表性溃疡以及其他慢性组织损伤等疾病的应用确有优势。有烟艾灸在燃烧过程所发出热、光、烟[14-15]，其中光谱辐射可能是促进发挥作用的关键因素，主要成分为近红外辐射[16-17]，它能够渗透至机体较深部位而发挥效应。另外，本课题将艾灸干预的温度控制在40～42℃[18-22]的适宜范围，旨在发挥艾灸治疗压力性损伤的最佳疗效的同时避免出现负损伤。本研究采用透绘法结合求积仪测定各组大鼠在不同时间点压力性损伤创面愈合率发现，3 d作为艾灸干预发挥促进创面愈合作用的起效时间，推测此疗效的发挥可能需要建立在累积一定刺激量的基础之上。因此，艾灸干预能够促进压力性损伤创面的愈合及修复，其疗效是确切的。压力性损伤大鼠创面局部的肉眼观察改变也与上述结论基本相符。

压力性损伤归属慢性及难愈性创面，由于在组织修复进程中的每一个阶段均较一般皮肤损伤相对滞后，因此，其具有相对复杂的修复过程，而肉芽组织的形成处于关键的核心地位。肉眼观察压力性损伤创面愈合过程发现，艾灸组大鼠压力性损伤创面肉芽组织在治疗3 d后出现，而模型组在碘伏处理7 d后出现，即在肉芽组织出现的时限上艾灸组发挥优势。在其生长状态上，两者比较亦是如此。艾灸组大鼠压力性损伤创面面积缩小较模型组更加显著，由此说明，艾灸干预促进压力性损伤创面的修复，疗效确切。HE染色结果发现，艾灸组大鼠创面组织中的炎细胞浸润高峰及肉芽组织出现时间均较模型组提前，成纤维细胞增生程度与数量更明显，且出现时限较早。艾灸组大鼠创面更早出现新生血管和表皮结构的恢复。由此说明，艾灸干预能够从皮肤愈合的三个关键时期（即炎症期、增生期和重塑期）分别促进创面的修复及愈合进程。即艾灸能够促进压力性损伤大鼠创面的愈合及修复，从整体上加速创面愈合的进程，从而缩短创面愈合的所需时间。本课题组在后续的研究中将分别通过透射电镜观察压力性损伤创面组织的超微结构、从基因及蛋白层面探讨艾灸促进压力性损伤组织创面修复的可能机制。

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（收稿日期：2017-11-30 本文编辑：任 念）