SIRT4对胃癌细胞增殖及周期的影响

2018-12-21黄国裕林瑶林佳浩陈旭旭李军建朱冠保

温州医科大学学报 2018年12期

黄国裕，林瑶，林佳浩，陈旭旭，李军建，朱冠保

（1.温州医科大学附属第一医院胃肠外科，浙江温州 325015；2.温州医科大学第一临床医学院，浙江温州 325035；3.温州医科大学附属第一医院肝胆外科，浙江温州 325015）

Sirtuins（SIRT）家族（SIRT 1-7）是一类依赖于NAD+-的乙酰化酶、脱乙酰酶和ADP-核糖转移酶家族，它们在基因组稳定性、能量代谢以及衰老等方面发挥着重要作用[1]。几乎所有的SIRT家族成员都被认为在肿瘤的发展中起着关键的作用[2]。SIRT4位于线粒体是NAD+-依赖的ADP核糖转移酶，它能抑制谷氨酰胺脱氢酶的活性[3]。研究表明，SIRT4可以通过抑制谷氨酰胺代谢从而具有抑癌基因的作用[4-5]。研究还发现SIRT4在结肠癌和食管癌中的表达降低与肿瘤的不良预后相关[6-8]。本课题组前期通过对胃癌组织芯片进行免疫组织化学实验发现，SIRT4的蛋白水平在胃癌组织中降低，并与更差的病理分级、T分期以及UICC分期相关[9]。然而，SIRT4对胃癌细胞的作用目前仍不清楚。本研究探讨过表达SIRT4对胃癌细胞SGC-7901和MNK45的体外增殖及周期的影响，以进一步明确SIRT4与胃癌的关系。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 载体和病毒产生：SIRT4慢病毒载体购自上海汉恒生物公司。表达SIRT4的载体为pHBLVCMVIE-ZsGreen-T2A-Puro。过表达慢病毒和阴性对照病毒的最终病毒滴度为2×108PFU/mL。

1.1.2 细胞系：人胃癌细胞系SGC-7901和MNK45购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

1.1.3 主要试剂：胎牛血清、DMEM培养基、DMEM高糖培养基、青霉素和链霉素购自美国Gibco公司；PI/Nase购自美国BD公司；RIPA缓冲液等免疫印迹试剂购自上海碧云天公司。抗体：兔抗人多克隆抗体（HPA029691，SIRT4）购自美国Sigma公司，兔抗人cyclin D蛋白单克隆抗体（60816-1-ig）购自武汉三鹰公司，兔抗人cyclin E单克隆抗体（ab33911）购自英国Abcam公司，兔抗人ERK多克隆抗体（9102）和兔抗人p-ERK多克隆抗体（4370）购自美国CST公司，羊抗兔抗体（ab97200）和兔抗人β-actin抗体（ab11971）购自英国Abcam公司，兔抗人GAPDH多克隆抗体（ab-p-r 001）购自深圳志贤生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分组：细胞在DMEM高糖培养基中培养，其中含有10%的胎牛血清以及青霉素和链霉素双抗。培养箱条件：37 ℃，5% CO2。过表达SIRT4的细胞系经慢病毒转导后，在2 μg/mL的嘌呤霉素中筛选2周。将细胞分为转染过表达SIRT4慢病毒（SIRT4）组和转染阴性对照病毒（Vector）组。

1.2.2 细胞增殖活力：以1 000细胞/孔接种于96孔板，每孔中加入10 µL CCK-8试剂，培养箱中培养2 h后，在450 nm波长处读取吸光度值。

1.2.3 平板克隆形成实验：将对数生长期细胞以100细胞/孔接种于6孔板，每2～3 d换液。培养2周后，将细胞用甲醇固定，再用姬姆萨染色后直接计数肉眼能观察到的集落数。

1.2.4 细胞周期实验：细胞经胰蛋白酶消化和离心分离后，悬浮在含3%胎牛血清的磷酸盐缓冲溶液中，用PI/Nase试剂盒进行染色，在流式细胞仪C6上进行检测，结果用ModFit分析软件（Verity Software House，TOPSHAM，ME，美国）分析。

1.2.5 Western blot实验：将细胞用RIPA缓冲液在冰水浴中裂解30 min，离心，收集上清液，用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。将等量的蛋白质加样到

1.3 统计学处理方法采用SPSS17.0软件进行统计分析。正态分布计量资料用±s表示，2组间比较用t检验，细胞周期分布用ModFit软件进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 过表达SIRT4对人胃癌细胞增殖的影响 CCK-8实验结果表明，过表达SIRT4后人胃癌细胞SGC-7901和MNK45的增殖活力显著下降，2组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图1B-C；SGC-7901和MNK45的克隆形成数目和大小在过表达SIRT4之后也明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1D。

2.2 过表达SIRT4对胃癌细胞周期的影响流式细胞术碘化丙胺染色法结果表明，与Vector组比，SIRT4组的SGC-7901和MNK45 G0/G1期细胞的分布显著增加，并且S期细胞的比例显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。在SGC-7901细胞中，过表达SIRT4增加了细胞在G2期的分布，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.3 过表达SIRT4对G1期相关蛋白的影响 Western blot检测表明，SIRT4降低了SGC-7901和MNK45细胞G1周期调节蛋白cyclin D、cyclin E和p-ERK表达，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

3 讨论

研究表明，多个SIRT家族成员在不同的肿瘤中扮演了不同的角色，这可能取决于特定的组织和肿瘤类型[10]。如SIRT1在胃癌[11]、结肠癌[12]、前列腺癌[13]及皮肤癌[14]中表达升高，但其在乳腺癌中的表达是降低的[15]，且在小鼠APC模型中过表达SIRT1可阻断小鼠肠道肿瘤的形成[16]。目前关于SIRT4在肿瘤中功能的研究不多，但都认为SIRT4具有抑癌基因的作用。JEONG等[4]发现SIRT4能通过抑制谷氨酰胺代谢来抑制肿瘤的形成；过表达SIRT4能抑制Hela细胞的增殖；敲除SIRT4的MEF细胞能在裸鼠中形成更大的肿瘤；敲除SIRT4基因的小鼠可自发形成肺癌、肝癌、乳腺癌和淋巴癌。CSIBI等[5]发现过表达SIRT4能抑制人结肠癌细胞株DLD-1和聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，通过电印迹法转移到PVDF膜上。将PVDF膜放置于10%脱脂乳蛋白中，在室温下孵育1 h后与稀释后的一抗在4O ℃条件下过夜。第2天用二抗室温下孵育30 min后用HRP-ECL荧光法检测目标蛋白，用凝胶成像仪器拍摄图像。人前列腺癌细胞株DU145的增殖。JEONG等[17]发现SIRT4对Myc诱导的B细胞淋巴瘤生长有抑制作用。

图1 过表达SIRT4抑制胃癌细胞增殖

图2 过表达SIRT4对胃癌细胞周期的影响

本课题组前期研究发现，SIRT4表达降低与结肠癌和食管癌患者更差的预后相关[6，8]，SIRT4在胃癌中的表达与胃癌患者的病理分期、T分期和UICC分期等病理学参数相关[9]。本研究实验结果表明SIRT4在胃癌中起着抑癌基因的作用。

为了进一步研究过表达SIRT4抑制胃癌细胞增殖的机制，本研究采用流式细胞术研究了过表达SIRT4之后胃癌细胞的周期分布。结果表明，过表达SIRT4导致了胃癌细胞SGC-7901和MNK45的G1期阻滞。此外，还观察到过表达SIRT4显著降低了胃癌细胞中cyclin D、cyclin E和p-ERK的表达。研究表明，细胞周期素D在癌细胞中的表达增加导致细胞生长失控[18]。ERK通过调节cyclin D[19]来控制G1期细胞周期。细胞周期素E在调节G1至S期转变[20]中也发挥着关键作用。这些结果提示，SIRT4诱导的G1期阻滞与ERK、cyclin D和cyclin E的下调有关。