携带线粒体ND1基因3497C＞T突变的Leber遗传性视神经病变家系临床与遗传学分析

梁敏，侯玲玲，姜丰，管敏鑫

（1.温州医科大学附属第一医院 医学检验中心，浙江 温州 325015；2.温州医科大学 Attardi线粒体生物医学研究院，浙江 温州 325035）

Leber遗传性视神经病变（Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON）是一种线粒体遗传性视神经疾病，主要发病人群为青年男性，发病年龄常在17～30岁[1-2]。眼科检查主要表现为双眼视力同时或先后下降，可有视野缺失或色觉障碍[3-5]。线粒体DNA（mtDNA）3个原发突变是LHON发病的分子基础[6-9]，线粒体新突变位点和继发突变位点在LHON的发病过程中起重要作用[10-13]。本研究主要对6个携带线粒体基因3497C＞T（m.3497C＞T）突变的LHON家系进行家系调查，对6例先证者进行了详细眼科学检查及线粒体基因组测序，并分析了m.3497C＞T突变对线粒体呼吸链复合物酶活性的影响。

1 对象和方法

1.1 对象 对6个携带m.3497C＞T突变的LHON家系进行家系调查，对家系先证者进行发病情况询问，并进行详细的眼科检查。选取无血缘关系的2名正常人作为正常对照，抽取先证者和正常对照者EDTA-K抗凝静脉血10 mL，其中5 mL用于建立转线粒体细胞系，其他用于提取全基因组DNA，-80 ℃保存。本研究经温州医科大学伦理委员会批准，参与本研究的患者家系及正常对照人群均已签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 眼科学检查：对6个家系先证者进行临床眼科检查，包括标准对数视力表检测视力，眼底镜，Canon CR6-45NM眼底照相机，光学相干断层扫描仪（OCT检查仪，德国Heidelberg公司）。双眼视力损伤参照WHO（http://www.who.int/en/）标准：正常≥0.3；0.1≤轻度损伤＜0.3；0.05≤中度损伤＜0.1；0.02≤重度损伤＜0.05；极重度损伤＜0.02。

1.2.2 线粒体基因组检测与分析：将6例家系先证者和2例正常对照者经EDTA-K2抗凝的全血用经典的酚/氯仿法提取全基因组DNA，NanoDrop1000测定浓度，-80 ℃保存备用。使用24对有部分重叠的正反向引物（引物可完全覆盖整个线粒体基因组序列）对6例家系先证者及对照者线粒体全基因组进行扩增，PCR产物使用AxyPrep PCR Clean-up Kit纯化后送杭州擎科生物科技有限公司测序。通过统计突变位点在正常对照者中的发生频率、线粒体多肽、rRNA或tRNA二级结构定位及种系发育分析等分析mtDNA其他突变位点致病性并确定其线粒体单体型。

1.2.3 转线粒体细胞系的构建及呼吸链复合物酶活力的分析：对6例先证者和2例正常对照者通过EB病毒转化建立人类永生化外周血淋巴母细胞系，按照King和Attardi方法建立转线粒体细胞系[14]，在含有单个克隆的培养皿内分离出状态稳定的细胞。按照常规酚-氯仿方法分别提取转线粒体细胞的DNA，检查其基因型，以证实所得到转线粒体细胞的线粒体来自相应的淋巴细胞。大量提取细胞线粒体，并进行线粒体蛋白浓度测定，进行线粒体呼吸链复合体酶活性的测定，评估m.3497C＞T突变对线粒体呼吸链复合物酶活力的影响。

2 结果

2.1 携带m.3497C＞T突变LHON家系的家系调查 6个LHON家系共158名成员，其中母系成员100名。每个家系都只有1名成员发病，6例患者中男性患者5例，女性患者1例，外显率分别为5%，6.25%，6.25%，4.76%，5.88%，10%。除LHON表现外，临床检查均未发现其他临床病症。见图1。

图1 6个携带m.3497C＞T突变位点家系的家系图（黑色代表患者，箭头代表先证者）

2.2 携带m.3497C＞T突变的先证者临床资料分析及眼科学检查 6例先证者中包含1例女性和5例男性，最小发病年龄7岁，最大37岁。2例重度视力损失，1例中度视力损失，3例轻度视力损失，见表1。眼底检查先用直接检眼镜检查，然后用眼底照相机拍照，如图2所示，患者主要表现为视盘色淡，边界不清，周围小血管迂曲。2例重度视力损伤患者中，LP002-IV-2患者表现为视盘颞侧色淡，小血管迂曲扩张，LP004-III-11患者双眼视盘颞侧色淡，边界不清。利用OCT对6例先证者视网膜神经纤维层（retinal nerve fiber layer，RNFL）厚度测量发现，LP002-IV-2患者RNFL在左眼的鼻侧和颞侧象限、右眼颞侧象限明显变薄，LP004-III-11患者双眼颞侧象限RNFL厚度明显变薄，其余4例患者RNFL厚度无明显变化，见图3。

2.3 携带m.3497C＞T突变的先证者线粒体全基因组分析 对6例携带m.3497C＞T突变的先证者行线粒体全序列分析，如表2所示，共发现74个变异位点，进一步分析显示这些突变均为同质性突变，包括67个已报道的和7个未报道的位点[15]。其中错义突变12个（10个已报道，2个新突变），并未发现与LHON相关的ND4基因11778G＞A，ND6基因14484T＞C，ND1基因3460G＞A三个原发突变位点。这些先证者线粒体单体型分别属于B4c1b、B4c1b、N9a4、B4c1、B4c1b和B4c1b2。

表1 携带线粒体ND1基因3497C＞T突变的6例先证者临床资料

图2 6例先证者眼底表现

2.4 携带m.3497C＞T突变的细胞株酶活力分析为了确定m.3497C＞T突变对线粒体氧化呼吸链各复合体活性的影响，测定携带m.3497C＞T突变的先证者和同属B单体型的正常对照样本（正常对照-1和正常对照-2）各复合体的酶活性。通过将复合体I、复合体II、复合体III和复合体IV的酶促反应速率以柠檬酸合酶的酶促反应速率为标准进行标准化，计算不同复合体样本间的相对酶活性[16]。研究显示，携带突变的患者复合体I的活性平均降低12.4%。各个细胞株复合体II、复合体III和复合体IV活性差异均无统计学意义（见图4）。

图3 6例先证者OCT检查结果

表2 携带线粒体ND1基因3497C＞T突变的6例先证者线粒体全序列分析

续表2

3 讨论

LHON最常累及青壮年男性，视力下降往往是突发性且永久性的，也难以矫正，这给患者带来了极大的痛苦。mtDNA 3个原发突变位点是LHON发病的分子基础，线粒体继发突变位点在LHON的发病过程中起着重要作用[10-13]。

图4 线粒体氧化呼吸链复合体酶活性的检测

本研究主要对6例携带m.3497C＞T突变位点的LHON家系进行调查，对6例先证者进行了详细的眼科学、分子和生化功能分析，这6例患者的发病年龄平均是20岁，这与其他携带m.11778G＞A突变的LHON家系一致[17]，然而这6个家系中，都只有一个成员患病，发病率显著低于携带三个原发突变的高加索人群[18]。我们对6例先证者进行眼底检查发现，这6例患者眼底均有不同程度的改变，部分患者眼底全部或部分苍白，符合视神经萎缩期的表现，也有部分患者视盘周围血管迂曲，视网膜水肿，为急性期表现[19]。研究显示，RNFL厚度在颞侧变化比较明显，颞侧纤维是最早和受累最严重的纤维，发病早期或临床前期，颞侧视盘黄斑束纤维水肿导致RNFL厚度增加，当病程超过6个月时，LHON处于萎缩期，此时，RNFL的厚度在各象限均变薄[20-24]。本研究中的2例重度视力损伤患者，其RNFL厚度已经明显变薄，而其他4例患者RNFL厚度无明显变化。

我们对6例先证者线粒体基因组全序分析发现均携带m.3497C＞T突变，该突变为已报道的与LHON相关的继发突变位点[18]。此外，m.3635G＞A、m.T12338T＞C、m.T14502＞C突变也能增加由m.G11778＞A突变所致LHON的临床表型[10，13，16]。此外，我们还发现了7个未报道的位点，分别为：D-Loop区268C＞T突变位点；ND1基因3435C＞T、3488T＞C、3632C＞T突变位点；ND2基因5057C＞T突变位点；NC区5895DelC突变位点和ND3基因10250A＞G突变位点。D-Loop区和NC区为非编码区，ND1基因3435C＞T，ND2基因5057C＞T和ND3基因10250A＞G突变位点突变后，并没有造成氨基酸的改变，故认为以上几种突变位点不是LHON表型发生的主要原因[25]。进一步对ND1基因3488T＞C和3632C＞T突变位点种系发育分析显示，在种族发育过程中这两个位点的保守型均＞75%[25]，可能协同m.3497C＞T突变位点致病。有研究显示，线粒体单体型B可能增加耳聋及高原型肺水肿的发病风险[26-27]。单体型D4j和M9a等在LHON的发病中起着重要作用[28-30]，这6例先证者线粒体单体型中5例为B4c型，我们推测单体型B4c可能协同影响LHON的发病。

ND1基因3635G＞A突变引起的线粒体蛋白质合成障碍导致线粒体氧化呼吸链复合体损伤，引起呼吸链复合物酶活性的改变，并直接影响了氧化呼吸效率[13]。本研究对6例携带m.3497C＞T突变的转线粒体细胞株呼吸链复合物酶活性分析发现，突变的细胞株其复合物I酶活性为对照细胞株的87.61%，各个细胞株复合体II、复合体III和复合体IV活性无显著差别，这说明m.3497C＞T突变影响了呼吸链复合物I的酶活性。

随着研究手段的增加，越来越多的新位点及继发位点的功能进一步得到验证，使得LHON的发病机制得到进一步阐明。本研究对携带m.3497C＞T突变的患者临床表型分析、眼底检查以及生化功能研究，结果均提示m.3497C＞T突变是这些家系发病的主要原因。因此，可将m.3497C＞T突变作为LHON易感人群的筛查位点，对携带该突变的携带者进行及时宣教并进行有效地预防。