紫铆因对骨肉瘤细胞凋亡和转移的影响及其机制

林增，潘天龙，吴登颖，康晓雕，蔡宁宇，潘骏

（温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 创伤骨科，浙江 温州 325027）

骨肉瘤是一种以高度恶性和转移为特点的疾病，是青少年和青年人最常见的骨肿瘤之一[1]。尽管化疗和外科手术治疗已有一定的进展，但其5年生存率仅为60%～70%[2]。大多数肿瘤患者的死亡原因为肿瘤的远处转移[3]。通过药物或手术的方式抑制肿瘤细胞的转移和侵袭，可以显著地提高肿瘤患者的长期生存率[4]。

目前常用的化疗药物为阿霉素、顺铂、甲氨蝶呤等，但长期使用有较大的不良反应甚至导致诸多并发症[5]。紫铆因是一种化学名为2’，3，4，4’-四羟基查尔酮（2’，3，4，4’-Tetrahydroxychalcone）的多酚类化合物，具有抗肿瘤、抗氧化及抗血管生成等多种生物活性。紫铆因的抗肿瘤作用在多种肿瘤细胞中通过了验证[6-8]，但是在骨肉瘤细胞方面的作用报道较少，因此本研究观察紫铆因对骨肉瘤细胞凋亡和转移的影响及其机制。

1 材料和方法

1.1 材料 U2OS骨肉瘤细胞株购自中国科学院生命科学研究院细胞库。紫铆因购自美国Sigma公司；胎牛血清、DMEM培养基购自美国Gibco公司；CCK-8检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天公司；Tunel试剂盒购自瑞士Roche公司；Bax、Bcl-2、基质金属蛋白水解酶（matrix metallo proteinases，MMP）-2、MMP-9抗体均购自美国CST公司；p-PI3K、p-Akt、GAPDH抗体、山羊抗兔抗体、山羊抗鼠抗体均购自美国Bioworld公司。

1.2 方法

1.2.1 肿瘤细胞培养： U2OS骨肉瘤细胞培养于含10%胎牛血清，1%青霉素、链霉素双抗的DMEM完全培养基。培养条件为37 ℃，CO2含量为5%的恒温培养箱。

1.2.2 细胞活性检测：以0、5、10、25、50和100 μmol/L紫铆因作用于骨肉瘤细胞24 h。使用CCK-8细胞活性试剂盒检测U2OS骨肉瘤细胞活性变化。

1.2.3 Western blot法检测相关蛋白的表达：使用0、25、50、100 μmol/L浓度的紫铆因试剂处理U2OS骨肉瘤细胞24 h后提取细胞总蛋白，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳、转膜，5% BSA封闭2 h，随后加入相应的一抗稀释液在4 ℃摇床冰箱孵育过夜。次日使用相应的二抗室温摇床孵育2 h，加入ECL显影液，化学发光显像仪上曝光分析。

1.2.4 Tunel染色检测凋亡：以0、25、50、100 μmol/L紫铆因处理骨肉瘤细24 h，4%多聚甲醛固定，3% H2O2封闭，1.5% TritonX-100通透。根据试剂盒说明书进行染色，37 ℃避光孵育30 min后DAPI染色60 s，PBS洗涤后使用滤纸吸干，滴加荧光防淬灭剂，透明指甲油封片，显微镜下观察。

1.3 统计学处理方法 使用SPSS19.0统计软件进行处理。数据以±s表示，每组实验均重复进行3次，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 紫铆因对U2OS骨肉瘤细胞活性的影响 经0、5、10、25、50和100 μmol/L紫铆因处理24 h，U2OS骨肉瘤细胞活性呈剂量依赖性地下降，25、50、100 μmol/L紫铆因处理组与0 μmol/L紫铆因组比，细胞活性差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 不同浓度紫铆因对U2OS骨肉瘤细胞活性的影响

2.2 紫铆因对U2OS骨肉瘤细胞凋亡的影响 经25、50、100 μmol/L紫铆因处理U2OS骨肉瘤细胞24 h后，Bcl-2相对表达量下降，Bax相对表达量升高，并呈浓度依赖性，50、100 μmol/L紫铆因处理组与0 μmol/L紫铆因组比，Bcl-2、Bax表达差异有统计学意义（P＜0.05），见图2；U2OS骨肉瘤细胞的凋亡率随着紫铆因浓度的增加而增强，50、100 μmol/L紫铆因处理组与0 μmol/L紫铆因组比，细胞凋亡百分比差异有统计学意义（P＜0.05），见图3-4。

2.3 紫铆因对U2OS骨肉瘤细胞侵袭转移作用的影响 0、25、50、100 μmol/L紫铆因处理U2OS骨肉

图2 不同浓度紫铆因对U2OS骨肉瘤细胞凋亡相关蛋白表达的影响

图3 不同浓度紫铆因对U2OS骨肉瘤细胞凋亡的影响（Tunel法）

图4 不同浓度紫铆因对U2OS骨肉瘤细胞凋亡百分比的影响

瘤细胞24 h后，U2OS骨肉瘤细胞中MMP-2、MMP-9的相对表达量下降，50、100 μmol/L紫铆因处理组与0 μmol/L紫铆因组比，MMP-2、MMP-9表达量差异均有统计学意义（P＜0.05），见图5。

2.4 紫铆因对U2OS骨肉瘤中PI3K-Akt信号通路的影响 通过使用0、25、50、100 μmol/L紫铆因处理U2OS骨肉瘤细胞24 h后，U2OS骨肉瘤细胞中磷酸化PI3K、Akt的相对表达量下降，50、100 μmol/L紫铆因处理组与0 μmol/L紫铆因组比，p-PI3K、p-Akt表达量差异均有统计学意义（P＜0.05），见图6。

3 讨论

本实验中，紫铆因在浓度达到50 μmol/L以上时，可呈剂量依赖性地抑制Bcl-2蛋白的表达，并提高Bax蛋白的表达，从而促进骨肉瘤细胞的凋亡反应，Tunel实验中阳性细胞百分比明显升高，起到抗肿瘤的作用。MMPs是一种通过降解细胞外基质并降低细胞之间黏附性的蛋白水解酶。研究表明，MMP-2、MMP-9与肿瘤细胞的侵袭和转移的关系最为密切[9-10]，降低肿瘤细胞中MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平，可以减弱肿瘤的侵袭和转移[11-12]。在本实验中，紫铆因在浓度达到50 μmol/L以上时，可呈剂量依赖性地抑制MMP-2、MMP-9蛋白的表达，进而起到一定的抑制肿瘤细胞侵袭和转移的作用。

图5 不同浓度紫铆因对U2OS骨肉瘤细胞侵袭转移的影响

图6 不同浓度紫铆因对U2OS骨肉瘤细胞中PI3K-Akt信号通路磷酸化的影响

有研究表明，骨肉瘤的发生、发展涉及多种细胞内信号通路的激活或抑制，其中PI3K-Akt信号通路最具代表性[13]。在骨肉瘤患者的大多数癌细胞中，均可以发现PI3K-Akt信号通路的相关蛋白被大量激活[14-15]。抑制肿瘤细胞内PI3K-Akt信号通路相关蛋白的激活，可以达到促进骨肉瘤细胞凋亡、抑制细胞内MMPs表达的作用[16]。本实验检测了骨肉瘤细胞中PI3K-Akt信号通路相关蛋白的表达情况，结果显示，在浓度达到50 μmol/L以上时，紫铆因呈剂量依赖性地抑制PI3K-Akt信号通路的磷酸化，表明紫铆因可能是通过抑制PI3K-Akt信号通路的激活来发挥抗肿瘤的作用。但是否有其他的信号通路参与其中，且各种通路之间是否具有一定的交互作用，仍需进一步研究验证。