Fsp27与肝纤维化病理、肝纤维化指标的相关性

余霞，黄卡特，俞富祥

（温州医科大学附属第一医院，浙江 温州 325015，1.病理科；2.肝胆外科）

肝纤维化是多种慢性肝脏疾病发展至肝硬化的必经阶段，肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）的活化与增殖是肝纤维化发生发展的中心环节[1-3]。Fsp27与细胞凋亡、能量代谢明显相关[4-5]，我们前期研究发现Fsp27能够通过抑制HSCs的活性进而在动物活体中具有一定的抗纤维化作用[6]。本研究拟通过探讨不同程度肝纤维化患者肝组织中Fsp27的分布、表达及其与肝纤维化分期、肝纤维化指标之间的相关性，明确Fsp27在临床肝纤维化进展过程中的作用。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2015年7月至2017年7月在温州医科大学附属第一医院因肝脏肿瘤而需行肝部分切除的患者45例，所有病例术前均行血清肝纤维化指标检测。其中男32例，女13例，年龄36～65岁。病理阅片由2位中级以上职称的病理科医师完成，按照慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）[7]的病理分期分为正常组（S0）、轻度肝纤维化组（S1、S2）及重度肝纤维化组（S3、S4），每组15例。本研究获温州医科大学附属第一医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 肝纤维化指标检测及肝脏胶原含量分析：测定各组患者术前血清III型胶原和透明质酸水平，按试剂盒说明（III型胶原试剂盒：上海科顺生物有限公司；血清透明质酸定量检测试剂盒：泉州市蓝图生物科技有限公司），采用放射免疫法。肝脏羟脯氨酸含量测定，按照试剂盒说明（羟脯氨酸检测试剂盒：上海盈公生物技术有限公司），取80 mg肝组织在冰冻条件下匀浆，匀浆液经37 ℃孵育消化过夜后，30×g常温离心并复溶于测试液中，匀浆液中的羟脯氨酸在550 nm波长处测定OD值，由已知羟脯氨酸浓度的标准液的OD值建立标准曲线，根据测试液的OD值计算出肝组织内的羟脯氨酸浓度。

1.2.2 病理检测：取各组肝脏行组织切片，肝切片标本用10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规脱蜡，将脱蜡后的切片置入苏木精水溶液中染色7 min，酸水及氨水中分色各10 s，流水冲洗1 h后置入蒸馏水5 min，然后于70%及90%的乙醇中各脱水10 min，然后分别进行HE染色或Masson染色。HE染色通过乙醇伊红染色液染色2～3 min。Masson染色通过Masson丽春红酸性复红液浸泡5～10 min。1%磷钼酸水溶液分化3～5 min，直接用苯胺蓝染5 min，以0.2%冰醋酸水溶液浸洗2 min。最后切片经脱水透明、封片观察。

1.2.3 免疫组织化学染色：组织石腊块切片、脱蜡、二甲苯甲醇脱水、枸橼酸修复，Fsp27抗体（1:200）孵育过夜，PBS洗涤3次，二抗（兔抗鼠IgG多聚体）37 ℃ 1 h，PBS冲洗3次后，DAB显色，光学显微镜下拍照。Fsp27单克隆抗体及DAB显色液均购自武汉博士德公司。免疫组织化学染色结果由3位高年资病理科医师采用双盲阅片进行判定。该蛋白以HSCs内出现棕黄色颗粒为阳性表达，无阳性细胞为0分，＜10%为1分，10%～50%为2分，＞50%为3分。

1.2.4 Real-time PCR检测Fsp27 mRNA在肝纤维化组织中的水平：取各组患者肝组织标本研磨，加Trizol抽提总RNA，设计针对Fsp27的特异性引物，对反转录cDNA进行real-time PCR反应，以GAPDH为内参。Real-time定量PCR按Trizol试剂盒说明书提取总RNA，测定RNA的浓度及纯度，反转录反应条件参照试剂盒说明，PCR反应条件为95 ℃变性15 s后，按95 ℃ 5 s变性，60 ℃ 30 s退火，共45个循环。Fsp27的引物序列为上游引物：5’-CCTCTATGACACAT ACTCGCTTTC-3’，下游引物：5-TGTTCTTCCTCAGTGGCA TCC-3’，长度168 bp。

1.2.5 Western blot检测肝纤维化组织中Fsp27蛋白的表达：Western blot法按照试剂盒说明提取细胞蛋白。分别加入现配的细胞裂解液，冰上裂解30 min，于4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，取上清进行蛋白定量。取一定量蛋白样品上样。SDSPAGE胶电泳分离，转移至PVDF膜，封闭缓冲液室温摇床振荡1 h，加入抗Fsp27蛋白单克隆抗体（购自美国Abcam公司，1:100），4 ℃过夜，TBST漂洗3次，10 min/次，孵育二抗（1:30 000），37 ℃恒温振摇1 h；TBST漂洗3次，10 min/次，化学发光，显影、定影，对胶片图像扫描，用凝胶图像处理系统Gel-Pro analyzer分析目标带的灰值。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS13.0软件进行统计分析。所有数据以±s表示，3组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK法，肝组织Fsp27蛋白染色评分与肝纤维化指标间的相关性采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝组织病理检测 与正常组比较，肝纤维化组光学显微镜下可见明显纤维化，纤维间隔粗厚，假小叶形成，肝细胞不同程度变性，胞质疏松化，并可见透明脂肪液滴分布。见图1。

2.2 肝脏组织Fsp27蛋白染色 在正常组中，肝组织Fsp27蛋白表达较强，主要位于肝小叶之间的原代HSLS，而随着肝纤维化加重，阳性染色逐渐减弱，且范围也逐渐减少。见图2。

2.3 Fsp27 mRNA在肝脏组织中的表达水平 与正常组比较，轻度肝纤维化组和重度肝纤维化组肝脏组织中Fsp27 mRNA表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与轻度肝纤维化组比，重度肝纤维化组肝脏组织中Fsp27 mRNA表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

2.4 Fsp27蛋白在肝脏组织中的表达水平 与正常组比较，轻度肝纤维化组和重度肝纤维化组肝脏组织中Fsp27蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与轻度肝纤维化组比，重度肝纤维化组肝脏组织中Fsp27蛋白表达水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

图2 3组肝脏病理切片Fsp27蛋白免疫组织化学染色结果（×100）

图3 3组肝组织中Fsp27 mRNA相对表达量的比较

2.5 肝组织Fsp27蛋白染色评分与肝纤维化指标之间的相关性 与正常组比，随着肝纤维化的逐渐加重，血清III型胶原、血清透明质酸、肝脏羟脯氨酸含量逐渐升高，Fsp27蛋白染色评分逐渐降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。Fsp27的蛋白染色评分与肝纤维化的严重程度呈显著负相关（Fsp27蛋白染色评分与血清III型胶原，r=-0.521，P＜0.05；Fsp27蛋白染色评分与血清透明质酸，r=-0.834，P＜0.05；Fsp27蛋白染色评分与肝脏羟脯氨酸，r=-0.667，P＜0.05）。

3 讨论

图4 3组肝组织中Fsp27蛋白相对表达量的比较

我国是肝炎高发国家，由肝纤维化导致的肝功能衰竭或肝癌是患者死亡的主要原因。HSCs是肝脏中的脂肪细胞，HSCs的持续活化是肝纤维化发生发展过程中的关键环节[2]。

Fsp27基因作为细胞凋亡因子家族成员，与脂肪细胞的分化和成熟密切相关。众多研究已显示促脂基因PPARγ能抑制HSCs活性延缓肝纤维化进展[8-10]，而有研究指出Fsp27正是PPARγ对脂肪细胞发挥效能的直接下游基因[11]。我们前期研究也已发现Fsp27在原代HSCs中高表达，而在活化HSCs中极低表达或不表达，在纤维化的肝组织中，外源性增强Fsp27的表达，也有类似PPARγ延缓肝纤维化的效能[6]。

表1 3组肝组织血清III型胶原、血清透明质酸、肝脏羟脯氨酸和Fsp27蛋白染色评分比较（每组15例，±s）

表1 3组肝组织血清III型胶原、血清透明质酸、肝脏羟脯氨酸和Fsp27蛋白染色评分比较（每组15例，±s）

与正常组比：aP＜0.05，与轻度肝纤维化组比：bP＜0.05

组别 血清III型胶原（µg/L） 血清透明质酸（ng/L） 肝脏羟脯氨酸（µg/g） Fsp27蛋白染色评分正常组 104.3±30.8 82.3±15.1 157.3±17.5 2.7±0.3轻度纤维化组 173.2±22.7a 256.3±37.1a 341.2±37.5a 1.6±0.4a重度纤维化组 237.8±43.3ab 486.3±44.7ab 435.3±70.6ab 1.1±0.4ab F 29.56 86.72 34.91 31.03 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

本研究通过免疫组织化学染色检查发现，Fsp27在正常肝组织中相对强表达，而随着肝纤维化加重，表达强度逐渐降低，而且在肝组织中阳性表达部位主要位于肝小叶之间的原代HSCs，但随着肝纤维的逐渐增加，在炎性坏死灶或汇管区纤维间隔内Fsp27的阳性表达量逐渐减弱。从以上结果再次验证了前期研究成果，即Fsp27主要高表达于原代HSCs，随着肝纤维化进程，肝组织中原代HSCs逐步活化，肝组织中高表达的Fsp27逐渐低表达，Fsp27与HSCs活化具有直接相关性。

血清III型胶原与透明质酸是临床上常用的反映肝纤维化情况的非创性检测指标之一，主要由HSCs合成和释放，是肝脏结缔组织基质中的主要成分，被认为是判断肝纤维化程度的较为敏感的检测指标。羟脯氨酸是机体胶原蛋白的主要特征性成分之一，测定肝脏组织的羟脯氨酸含量，也是反映肝脏纤维化程度的敏感指标之一。本研究通过对各不同阶段的肝纤维化患者的肝组织Fsp27 mRNA、Fsp27蛋白、肝羟脯氨酸含量及血清肝纤维化指标的研究发现，Fsp27在肝脏的表达强弱与肝纤维化的进展程度具有密切联系，随着肝纤维化的逐渐加重，肝脏组织中Fsp27的表达水平逐渐降低。相关性分析结果也显示，Fsp27的阳性表达评分和反映肝纤维化的指标呈显著负相关。

本研究显示，Fsp27基因不仅能够抑制HSCs活性、延缓肝纤维化进展，而且肝组织中Fsp27的表达与患者肝纤维化病理的严重程度具有明显的负相关，与肝纤维化常用指标（血清III型胶原、透明质酸与肝脏羟脯氨酸）也具有很好的负相关性。因此，肝组织中Fsp27可作为反映肝纤维化一个很好的负向指标。但是，Fsp27通过何种分子通路，如何具体影响HSCs纤维化相关基因的表达以及过表达的Fsp27是否会引发脂肪肝等，尚待进一步研究。