滋养肝肾法对初老模型大鼠卵巢储备功能下降的调节作用及机制

包红桃 谢知慧 李应福 王宝泉 晏 鹏 董娟娟 刘双萍 武权生

(甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000)

卵巢储备功能(OR)是指卵巢皮质区卵泡生长、发育、形成可受精卵泡的能力，反映女性生育潜能和生殖内分泌功能〔1,2〕。卵巢储备功能下降(DOR)指卵巢产生卵子能力减弱、卵泡质量下降，导致女性生育能力下降及性激素缺乏，临床多表现为月经稀发、经期不规则、闭经、不孕等〔3〕，DOR时卵巢抑制素生成减少，对垂体的抑制作用减弱使促卵泡生成素(FSH)分泌增加，而内源性FSH 的持续升高可加速窦卵泡的消耗。如不积极干预最终将导致卵子的耗竭发生卵巢早衰，失去最佳治疗机会。DOR发生与年龄、婚育状况、宫腔操作次数、心理、吸烟、减肥药服用史、雷公藤服用史、卵巢手术史、腮腺炎病史等诸多因素有关〔4〕。DOR发生率为10%〔5〕，是一个渐进性过程，常在 1～6 年内发展为卵巢衰竭。现有DOR中医、西医治疗手段都有不同的局限性〔6～12〕。近年来，致力于中医药改善OR的研究、探索日益增多，并已取得显著临床疗效。传统中医诊治疾病的整体观念与辨证论治原则显得尤为重要。本研究旨在阐释中医药改善DOR的优势。

1 材料与方法

1.1实验动物 采用自然老化的初老模型，SPF级SD大鼠，雌性，12～13月龄，体重240～440 g；5月龄青年大鼠，体重180～220 g。由甘肃中医药大学SPF级实验室提供。实验过程室温保持(21±2)℃，相对湿度60%～70%，动物购进后适应性喂养4 d。

1.2实验药物 所需中药材均由甘肃中医药大学附属医院中药房同一批购进。戊酸雌二醇片(补佳乐，生产厂家：拜耳医药保健有限公司广州分公司，批号：国药准字J20130009，剂型：片剂，规格：1 mg×21片，批号：国药准字J20130009)。实验试剂：FSH和黄体生成素(LH)试剂盒均购自欣博盛生物科技有限公司。

1.3实验方法 以阴道上皮角化试验验证模型〔13,14〕。按大鼠动情周期阴道涂片的细胞变化特点来划分动情周期的各阶段。通过阴道脱落细胞分析对60只13周龄SD雌性初老大鼠连续15 d进行阴道涂片、镜检，观察阴道组织涂片中细胞的变化，记录图像并分析。筛选出50只动情周期紊乱、动情间期延长提示DOR模型大鼠后随机分为模型组、组方高剂量组、组方中剂量组、组方低剂量组、补佳乐组。5月龄雌性大鼠10只为青年组。

1.3.1给药 除模型组、青年组灌服等体积生理盐水外，其余各组均按体表面积折算成人的等效剂量给药，组方高(2.12 g·kg-1·d-1)、中(1.06 g·kg-1·d-1)、低剂量组(0.53 g·kg-1·d-1)，每日2次；补佳乐组0.03 g·kg-1·d-1，1次/d，均连续7 d。

1.3.2标本采集 阴道脱落细胞采集方法：用自制的无菌棉签蘸取少量生理盐水浸湿后插入大鼠阴道，充分蘸取分泌物后取出，在玻片上轻轻滚动，使分泌物均匀涂布于玻片上，待涂片自然风干后，以95%的酒精固定、瑞氏染色。最后一次灌胃后1～2 h眼眶采血，离心后，取上清液，用酶联免疫吸附试验(ELISA)监测FSH、LH(按试剂盒说明操作)，处死大鼠摘取卵巢，用10%的甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，常规苏木素-伊红(HE)染色，在光镜下观察卵泡数量。

1.4统计学方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析，方差齐者采用Bonferroni法，方差不齐者采用DunnettT3法。

2 结 果

2.1各组血清FSH、LH的表达 与模型组比较，组方高、中、低剂量组、补佳乐组血清FSH、LH明显降低(P<0.05)，模型组血清FSH、LH值显著高于青年组(P<0.05)；补佳乐组血清FSH、LH值显著低于组方高、低剂量组(P<0.05)，而与组方中剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)；组方高、中、低剂量组、补佳乐组能明显降血清FSH、LH表达水平，且中剂量组效果最显著(P<0.01)。见表1。

2.2各组卵泡数量 青年组表现为卵巢体积大，卵泡生长活跃，可见各级卵泡，颗粒细胞层次多，卵泡液含量多，黄体发育良好，体积大，血管丰富；模型组可见卵巢萎缩，卵泡数减少，无黄体，卵母细胞颗粒层数减少，闭锁卵泡数增多，卵泡内细胞排列出现紊乱；组方高、低剂量组可见卵巢略有萎缩，卵泡数略有增多，黄体数量略少，卵母细胞颗粒层数较多；组方中剂量、补佳乐组可见卵巢体积正常大小，各级卵泡数均较多，卵泡液含量多，黄体数较多，卵母颗粒细胞层次增多，以组方中剂量组尤为明显。见图1。

表1 各组血清 FSH、LH表达水平

与青年组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01；与补佳乐组比较：4)P<0.05

图1 各组卵巢组织中卵泡数量(×10)

3 讨 论

中医药防治DOR从多方面、多环节入手，对人体具有整体调节作用，中医药补肾活血，调肝健脾、滋阴补肾、补肾祛瘀等效果显著〔15，16〕。西医常采用激素治疗DOR，但其副作用较大，患者服药期间易擅自停药等。应用“肝肾同源，精血互生”病机理论，从整体出发，辨证论治，具有整体调控和多靶点、多方式调节的特点。临床经验方滋养肝肾组方加以优化后筛选出以炙黄芪35 g、淫羊藿15 g、生地12 g、熟地15 g、枸杞15 g、当归20 g、盐泽泻12 g、茯苓15 g、太子参30 g、麸炒白术18 g、陈皮6 g、女贞子15 g、酒萸肉12 g、炒山药15 g、炒白芍15 g、墨旱莲15 g、何首乌15 g、酒黄精15 g、鹿角胶10 g、龟甲胶15 g、甘草6 g具有地域特色药材为主的基本配伍组方，本研究说明滋养肝肾组方通过滋养肝肾调节机体生殖内分泌功能，改善DOR的作用，从而稳定机体内环境。