PTEN蛋白缺失与PI3K抑制剂对非小细胞肺癌的作用

杨军峰 赵 璞 张 全 务 森

(河南省人民医院胸外科 ，河南 郑州 450000)

非小细胞肺癌(NSCLC)发病率和病死率占恶性肿瘤的首位〔1〕。人第10号染色体确实的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)在肺癌磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)通路中起重要的调节作用，其蛋白表达缺失与NSCLC不良预后相关〔2，3〕。研究发现，3.8%的NSCLC患者的PTEN基因在RNA水平存在大片段缺失，而且大部分缺失与表皮生长因子受体(EGFR)敏感突变共存，表明PTEN缺失在NSCLC发生、发展、治疗中不是一种孤立现象，但其失活机制及在通路中的作用仍未阐明〔4〕。本研究拟分析PTEN缺失与PI3K抑制剂对NSCLC细胞系的作用关系，旨在阐释PTEN缺失的分子机制，为丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)抑制剂的临床应用筛选合适的分子标记物。

1 材料与方法

1.1细胞株及主要试剂 H1793细胞〔美国物种保存中心(ATCC)〕;PI3K抑制剂GSK2636771(美国MCE公司)；总RNA提取试剂盒(上海超研生物科技有限公司)；RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)；Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒(美国BD公司)；抗体磷酸化(p)-EGFR、p-AKT、P-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)(美国CST公司)；PTEN探针RP11-846G17(多伦多应用基因学，加拿大，光谱标记)；pBP-PTEN质粒(武汉淼灵生物科技有限公司)；DH5α大肠杆菌菌株(本院保存)。其他试剂均为分析纯国产试剂。

1.2主要仪器 超净工作台(AIRTECH，苏州净化设备有限公司)，精密电子天平(Adventurer公司，美国)，倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)，双垂直蛋白电泳仪(北京市六一仪器厂)，紫外分光光度计(Nano Drop公司)，酶标仪(Thermo公司)，流式细胞仪(美国BD公司)。

1.3细胞培养 用含100 U/ml青霉素、链霉素及10% FBS的RPMI1640培养基，于5% CO2细胞培养箱中37℃培养，0.25%胰蛋白酶消化传代，倒置显微镜下观察。

1.4基因扩增、转染、筛选及鉴定 将真核表达载体pBP-PTEN转化DH5α菌株，克隆并扩增，提取并纯化质粒DNA。酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，常规培养。取对数生长期的H1793细胞，采用脂质体介导法将pBP-PTEN质粒转染入H1793细胞。挑选阳性细胞克隆，扩增培养。将成功转染pBP-PTEN质粒的H1793细胞命名为H1793-pBP-PTEN细胞。

1.5荧光原位杂交(FISH)法检测PTEN表达情况 采用PTEN探针RP11-846G17(标记红色荧光)，按标准FISH操作流程进行检测。玻片56℃孵育24 h，常规脱蜡、脱水，于80℃柠檬酸钠缓冲液(SSC)中50 min，SSC漂洗；消化后继续孵育10 min，梯度洒精脱水，80℃变性后加入探针，37℃过夜，室温SSC冲洗2 min，水洗，镜检。

1.6分组 实验分为对照组、糖原合成酶(GSK)低剂量组(10 μmol/L)、GSK中剂量组(20 μmol/L)和GSK高剂量组(30 μmol/L)。

1.7MTT比色法检测细胞增殖情况 配制5 mg/ml的MTT溶液；96孔细胞铺板，转染，转染后24 h、48 h、72 h、96 h检测MTT，每组设3个复孔；检测时每孔更换180 μl RMPI1640培养液，再加入20 μl MTT溶液；37℃孵育4 h后，吸出孔内培养基。每孔加入二甲基亚矾(DMSO)150 μl，振摇10 min，490 nm处酶标仪测量OD值。

1.8流式细胞术检测细胞凋亡 配备10～50 μmol/L 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)溶液，加1/10 DAPI于细胞中，37℃，10～20 min。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次。用荧光显微镜(EX 360 nm，EM 460 nm)观察。Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞的凋亡指数：把处理的细胞消化、中和、离心、PBS洗2遍，离心去上清，250 μl结合缓冲液重悬，取100 μl加入Annexin V-FITC 5 μl、PI 10 μl,避光室温15 min后加入PBS 400 μl上机；将Annexin V-FITC/PI加入到孵育缓冲液中，终浓度均为1 μg/ml，用孵育缓冲液洗涤1次，1 000 r/min 离心5 min；用100 μl的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15 min，1 000 r/min离心5 min沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次；加入荧光(SA-FLOUS)溶液4℃孵育20 min，避光并振动；流式细胞仪激发光波长488 nm，用波长515 nm的通带滤器检测异硫氰酸荧光素(FITC)荧光，另一波长大于560 nm 的滤器检测PI。细胞凋亡情况应用Cell Quest 软件进行分析。

1.9Western印迹法检测 EGFR信号通路相关蛋白表达 取对数生长期细胞，按照实验分组预处理细胞24 h，收集细胞，提取蛋白。取35 μg蛋白上样进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜后，用5%脱脂奶粉封闭2 h，将膜转入一抗(p-EG-FR、 p-AKT、p-mTOR)稀释液中4℃过夜，PBS洗3次，对应二抗室温孵育2 h，PBS洗3次，显影。

1.10统计分析 采用SPSS18.0软件进行χ2检验、t检验、方差分析。

2 结 果

2.1PTEN表达情况 PTEN定位于细胞核内，在H1793细胞内为阴性表达，在H1793-pBP-PTEN细胞内呈阳性表达，显红色荧光，证实PTEN成功转入H1793细胞并获得表达。见图1。

图1 PTEN的表达(×400)

2.2PI3K抑制剂对细胞增殖的影响 PI3K抑制剂作用72 h后，相同浓度PI3K抑制剂对H1793细胞株和H1793-pBP-PTEN细胞株的抑制率比较存在显著性差异(P<0.05)。GSK高剂量组对H1793细胞株和H1793-pBP-PTEN细胞株的抑制率高于GSK低剂量组和GSK中剂量组(P<0.05)，GSK中剂量组对H1793细胞株和H1793-pBP-PTEN细胞株的抑制率高于GSK低剂量组(P<0.05)。见表1。

表1 PI3K抑制剂作用72 h后的A值和抑制率

与GSK高剂量组比较：1)P<0.05；与GSK中剂量组比较：2)P<0.05

2.3PI3K抑制剂对细胞凋亡的影响 处理48 h后GSK低、中和高剂量组H1793细胞株凋亡率分别为8.22%、12.12%和18.93%，H1793-pBP-PTEN细胞株凋亡率分别为18.29%、26.83%和39.67%。相同浓度PI3K抑制剂作用下，H1793细胞株和H1793-pBP-PTEN细胞株的凋亡率比较差异显著(P<0.05)。GSK高剂量组对H1793细胞株和H1793-pBP-PTEN细胞株的凋亡率高于GSK低剂量组和GSK中剂量组(P<0.05)，GSK中剂量组对H1793细胞株和H1793-pBP-PTEN细胞株的凋亡率高于GSK低剂量组。

2.4PI3K抑制剂对信号通路的影响 随着PI3K抑制剂浓度增加，H1793细胞株和H1793-pBP-PTEN细胞株 p-EGFR、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平均下降，且H1793-pBP-PTEN细胞株p-EGFR、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显著低于H1793细胞株(P<0.05)。GSK低剂量组H1793细胞株和H1793-pBP-PTEN细胞p-EGFR、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平均高于GSK中剂量组和GSK中剂量组(P<0.05)，GSK中剂量组H1793细胞株和H1793-pBP-PTEN细胞p-EGFR、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平均高于GSK高剂量组(P<0.05)。见表2。

表2 PI3K抑制剂对信号通路的影响

与H1793细胞株比较:1)P<0.05；与GSK高剂量组比较：2)P<0.05；与GSK中剂量组比较：3)P<0.05

3 讨 论

著名的吉非替尼(易瑞沙)泛亚洲研究(IPASS)为肺癌靶向治疗树立了里程碑，EGFR突变型NSCLC患者采用小分子酪氨酸激酶抑制剂靶向治疗临床疗效十分显著〔5〕。研究显示，靶向药克唑替尼对微管相关类蛋白样(EML)4间变淋巴瘤激酶(ALK)融合基因突变的NSCLC患者同样效果显著。由此可见，基于分子靶点的靶向抑制剂治疗已发展成肺癌“个体化”治疗的有效模式，EGFR突变型肺癌、EML4-ALK融合型肺癌做为明确的肺癌分子亚型，单一的病理分型已不能满足临床需要〔6〕。驱动因子及其分子机制研究在肺癌的发生、发展过程中取得喜人的进展，发现了许多药物治疗靶点，为NSCLC治疗提供多种选择。

国内外均报道了NSCLC的基因突变谱，50%的肺腺癌伴有驱动基因的突变，为NSCLC的靶向治疗提供了分子基础〔7〕。有报道称，在50%的NSCLC患者中含成纤维细胞生长因子受体(FGFR)1扩增、盘状结构域受体(DDR)2突变或PIK3CA 突变/PTEN缺失，提示这几个基因可能是NSCLC发生、发展的主要驱动因子，也可能成为靶向药物治疗的靶点〔8〕。EGFR是目前倍受瞩目的肿瘤治疗靶点。EGFR通过RAS-RAF-MEK-ERK/MAPK通路和PI3K/AKT两条通路参与调控细胞的生长和分化，这两条通路的失调控可导致肿瘤的发生、发展。PTEN基因包含一个与脂质结合的C2区，一个氨基端磷酸酶区域和一个羧基端区域。PTEN基因cDNA 5′末端存在着由近804个核苷酸组成的非翻译区，并含有许多基因启动子区域CpG双核苷酸岛结构，可为其发生DNA甲基化提供可能〔9，10〕。

本研究显示，PI3K抑制剂GSK2636771可显著抑制H1973细胞增殖，促使肿瘤细胞凋亡。H1973 细胞为PTEN表达缺失的肺癌细胞株，通过脂质体介导法成功将pBP-PTEN质粒转染入H1973肿瘤细胞，PI3K抑制剂的抑制细胞增殖和促凋亡作用得到增强，提示PTEN在PI3K抑制剂抗肿瘤作用中扮演重要角色，其表达缺失预示着肺癌H1973 细胞对PI3K抑制剂不敏感。因此，检测NSCLC患者PTEN基因表达水平对评估PI3K抑制剂治疗疗效及预后有重要意义。

PI3K/AKT/mTOR信号传导通路通过调控下游分子，参与调节基因转录、翻译、细胞凋亡及细胞周期，在多种肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用〔11，12〕。作为一个抑癌基因，PTEN可抑制肿瘤的进展，负调节蛋白激酶信号级联作用。PTEN的磷酸化区域是肿瘤抑制子活性区，但其关键作用是脂磷酸化作用，而不是蛋白磷酸化作用〔13〕。实验证实，PTEN主要通过其脂质磷酸酶活性作用于PI3K的下游靶分子PIP3从而阻断PI3K/AKT信号通路实现抑癌作用，故有学者将其称为PTEN-PI3K/AKT信号转导通路〔14〕。此外，AKT是PTEN的一个重要作用靶点，PTEN缺失是AKT失调控的一个重要原因。AKT的活化在肺癌的形成和进展中起重要作用，因此，AKT是肿瘤治疗的靶点〔15，16〕。本研究结果显示，PI3K抑制剂对H1793-pBP-PTEN细胞株PI3K/AKT/mTOR信号抑制作用更明显。