miR-92a在大鼠缺血再灌注心肌组织中的表达及对心肌细胞凋亡的影响

张黎静 黄峥嵘 孙文超

(厦门大学附属第一医院心内科，福建 厦门 361000)

缺血再灌注(I/R)损伤是一种在心肌组织缺血后，重新恢复血流供应时，细胞代谢的功能障碍及结构损伤进一步恶化的现象，是临床上在心脏手术后，引起心肌损伤的重要原因〔1〕。缺血性心脏病是临床上常见的心肌I/R引起的心脏损伤。细胞凋亡是维持细胞稳态的重要过程，但其过度活跃则会导致I/R组织损伤〔2〕。微小RNA(miRNA)是基因表达的调节器，参与多种疾病的病理生理过程，而其在心血管疾病中的作用也备受关注和重视。miR-92a是miRNAs中的一员，在宫颈癌、白血病和肝癌等多种肿瘤疾病中表达上调，在肿瘤细胞增殖凋亡等生理过程中发挥重要调控作用〔3～5〕。研究发现，miR-92a在心血管疾病中发挥重要作用，抑制其表达可提高再内皮化和防止血管损伤后新生内膜形成〔6〕。本研究通过观察miR-92a在I/R后大鼠模型心肌组织中的表达，探讨其对心肌细胞凋亡的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 实验用清洁级SD大鼠20只，鼠龄6～8 w，雄性，体重200～300 g，出生1～3 d的新生SD乳鼠10只，购于上海市实验动物中心。

1.2试剂和仪器 miR-92a抑制剂(miR-92a inhibitor)和miR-92a 阴性对照(miR-92a NC)购于上海吉玛制药有限公司。DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶和Lipofectamine2000脂质体转染试剂均购于美国Gibco公司，放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液、Trizol试剂购于美国Invitrogen公司，电化学发光(ECL)试剂盒、RNA提取试剂盒和RNA逆转录试剂盒购于大连Takara公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒和膜联蛋白-V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(FITC-Annexin V/PI)凋亡试剂盒购于南京凯基公司；淋巴瘤/白血病(Bcl)-2单克隆抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3多克隆抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗鼠或抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗均购于美国Santa cruz公司。动物呼吸机购于浙江大学医学仪器有限公司，CO2培养箱、紫外可见分光光度计购于美国Thermo公司，PCR仪、电泳仪和流式细胞仪购于美国Becton Dickinson公司。

1.3方法

1.3.1I/R损伤模型的制备 将SD大鼠以每组10只随机分为I/R组和假手术组，所有大鼠经10%水合氯醛麻醉后，固定，行气管插管，接通呼吸机机械通气。对I/R组大鼠结扎冠状动脉30 min后松开建立心肌缺血大鼠模型，在恢复供血后再灌注2 h。实验过程中采用心电图进行监测，在结扎后，出现心电图ST段抬高、T波高耸等表现，而松开动脉夹开放供血后，出现抬高的ST段开始降低、T波慢慢恢复的现象，则表示I/R建模成功。

1.3.2心肌细胞培养及缺氧/复氧(H/R)模型建立 取新生SD乳鼠，以酒精消毒后，在无菌环境下处死取其心脏。以无菌眼科剪将其制成组织碎块，加入胰蛋白酶于冰上预处理30 min后，搅拌器搅拌，取上清液；再向组织碎块中加胰蛋白酶，预处理，搅拌，取上清液，重复3次后，将所有上清液合并离心。弃上清后加入DMEM培养液，重悬细胞后接种于培养皿中，于CO2培养箱中常规培养。待细胞贴壁生长时，取上清液，细胞计数后接种于6孔细胞板上，其中培养液为含有20%胎牛血清DMEM培养液。加入浓度0.1 mmol/L 5-溴脱氧核苷，培养72 h后，将细胞随机分为常氧组和H/R组。其中，H/R组细胞经无血清处理12 h后，在1%O2-94%N2-5%CO237℃的培养箱中继续培养24 h，取出培养板，再转至95%空气-5%CO2培养箱中培养2 h。常氧组细胞则一直在95%空气-5%CO2培养箱中培养。

1.3.3miR-92a检测 分别取新鲜的心肌组织和心肌细胞，加入Trizol提取细胞总RNA，采用紫外可见分光光度计测定所提到的总RNA的浓度及纯度，以RNA反转录试剂盒将心肌组织或细胞的总RNA逆转录成cDNA。以cDNA为模板，加入引物0.2 μl及相应组分制成10 μl的反应体系，按照95℃预变性180 s(1个循环)、95℃变性10 s(35个循环)、60℃退火20 s(35个循环)、72℃延伸10 s(35个循环)和72℃总延伸300 s(1个循环)的反应条件进行PCR扩增。以U6为内参基因，采用2-△△Ct法计算miR-92a在心肌组织和细胞中的相对表达水平。

1.3.4细胞转染及分组 将制备的原代心肌细胞，调整细胞密度为6×106个/ml后接种于96孔细胞板上，置于CO2培养箱中常规培养24 h。将其随机分为对照组，miR-92a NC组和miR-92a inhibitor组。以Lipofectamine2000将miR-92a 抑制剂和miR-92a 阴性对照分别转染至miR-92a inhibitor组和miR-92a NC组细胞中，空白对照组细胞不做转染，其中miR-92a 抑制剂和miR-92a 阴性对照的浓度为20 nmol/L。转染6 h后，更换培养液后继续培养48 h。以1.3.3中的实验方法检测其转染效果。

将制备的原代心肌细胞，调整细胞密度后接种于96孔细胞板上，置于CO2培养箱中常规培养。将其随机分为对照组、I/R组和I/R+miR-92a inhibitor组。将I/R组和miR-92a inhibitor+I/R组细胞在经无血清处理12 h后，在条件为1%O2-94%N2-5%CO237℃的培养箱中继续陪养24 h，取出培养板，转至95%空气-5%CO2培养箱中继续培养。其中miR-92a inhibitor+I/R组细胞继续培养2 h后，以Lipofectamine2000将miR-92a抑制剂转染至细胞中，转染4 h后更换培养液继续培养48 h。

1.3.5细胞凋亡实验 收集上述对照组、I/R组和I/R+miR-92a inhibitor组细胞，以胰蛋白酶消化后，加入结合缓冲液重悬细胞。向含有105个细胞的100 μl细胞悬液中加入Annexin V-FITC 5 μl染色10 min后，再加入PI 10 μl染色，补加结合缓冲液500 μl，上流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。

1.3.6凋亡相关蛋白的检测 收集对照组、I/R组和I/R+miR-92a inhibitor组细胞，以RIPA裂解液裂解各组细胞，提取细胞总蛋白，BCA试剂盒检测提取各组总蛋白的浓度。将蛋白置于沸水浴中变性后，取50 μg蛋白样品，于5%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中进行分离。电转印到聚偏二氟乙烯膜上，经封闭液4 ℃下封闭3 h后，加入Bcl-2(1∶1 000)、酶切Caspase-3(1∶1 000稀释的)和GAPDH(1∶1 000)抗体，于4 ℃过夜，再以二抗(1∶2 000)室温反应2 h，ECL试剂盒发光显影，自动凝胶成像系统采集图像。以GAPDH作为内参，分析Bcl-2和酶切Caspase-3蛋白的相对表达水平。

1.4统计学分析 采用SPSS19.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD-t检验。

2 结 果

2.1miR-92a在缺血再灌注心肌组织中的表达 与假手术组(1.02±0.03)相比，I/R组心肌组织中miR-92a的相对表达水平(2.35±0.16)显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2miR-92a在缺血再灌注后心肌细胞中表达及转染效果 H/R组心肌细胞中miR-92a的相对表达水平(3.12±0.25)较常氧组(0.96±0.08)显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测转染48 h后对照组、miR-92a NC组和miR-92a inhibitor组心肌细胞中miR-92a的相对表达水平分别为(1.10±0.05)、(0.96±0.06)和(0.23±0.06)。与对照组相比，miR-92a NC组细胞中miR-92a的相对表达差异无统计学意义(P>0.05)，miR-92a inhibitor组细胞中miR-92a的相对表达量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3miR-92a对心肌细胞凋亡的影响 与对照组(6.38±0.52)%相比，I/R组细胞凋亡率(21.35±1.06)%显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；I/R+miR-92a inhibitor组细胞凋亡率(15.28±2.15)%较I/R组显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4miR-92a对Bcl-2和酶切Caspase-3蛋白表达的影响 与对照组相比，I/R组细胞中Bcl-2蛋白的相对表达量显著降低，酶切Caspase-3蛋白的相对表达量显著升高(P<0.05)；与I/R组比较，I/R+miR-92a inhibitor组细胞中Bcl-2蛋白的相对表达量显著升高，酶切Caspase-3蛋白的相对表达量显著降低(P<0.05)。见图1，表1。

图1 Western印迹检测

组别Bcl-2酶切Caspase-3对照组0.92±0.050.14±0.03I/R组0.25±0.031)0.55±0.081)I/R+miR-92a inhibitor组0.68±0.062)0.23±0.042)F/P值148.157/0.00046.955/0.000

与对照组相比：1)P<0.05；与I/R组相比：2)P<0.05

3 讨 论

MiR-92a基因家族是癌基因miR-17-92基因簇中的重要成员，它包括结构相似、序列相似和种子区序列相同的miR-25、 miR-363、miR-92a～1和miR-92a～2 的4个成员，是一类高度保守的与血管内皮细胞形成密切相关的miRNA；成熟的MiR-92a基因是由miR-92a～1和miR-92a～2基因生成〔9，10〕。研究发现，miR-92a在胃癌和结直肠癌等组织中呈现高表达，与淋巴结转移和预后密切相关〔11，12〕。miR-92a还参与多种疾病细胞增殖凋亡的生理病理过程。Iaconetti等〔13〕通过体外实验发现抑制miR-92a表达能够促进血管平滑肌细胞的增殖和迁移。Niu等〔14〕发现，miR-92a反义寡核苷酸通过逆表达BCL2L11诱导人脑胶质瘤细胞凋亡。Murata等〔15〕研究指出，通过抑制miR-92a能够促进血管再生增强骨折愈合能力，在组织修复方面具有重要作用。本研究结果提示，下调miR-92表达可抑制I/R引起的细胞凋亡，进而起到减轻心肌缺血再灌注损伤的作用。

细胞凋亡是机体维护内环境稳态的程序性死亡过程，心肌细胞凋亡与心肌缺血再灌注损伤程度密切相关，抑制心肌细胞凋亡是改善心肌缺血再灌注损伤的有效途径。细胞凋亡是十分复杂而又严密的过程，受到多种基因和蛋白的多途径调控。Bcl-2是公认的抗细胞凋亡基因，是细胞凋亡线粒体途径的重要调控因子；Caspase-3是公认的细胞凋亡过程的执行者，在细胞凋亡过程中发挥着重要的核心调控作用〔16，17〕。Bcl-2和Caspase-3均是反应细胞凋亡的重要指标，缺血-再灌注后使心肌细胞受到刺激产生大量的自由基，引起细胞膜和线粒体等损伤，通过不同途径激活或调控Caspase-3和Bcl-2基因，诱发细胞凋亡，与心肌细胞的凋亡过程密切相关。姚红玲等〔18〕研究发现，心肌缺血/再灌注组大鼠肺组织中Caspase-3表达显著升高和Bcl-2表达显著减少。牛巍巍等〔19〕发现，miR-92a可能通过调控Bcl-2来抑制细胞凋亡。Lan等〔20〕研究指出，过表达miR-92a能够通过MKK4-JNK1途径和酶切Caspase-3蛋白的表达抑制H2O2诱导血管平滑肌细胞凋亡。本研究结果提示，miR-92a可能通过上调Bcl-2蛋白和下调酶切Caspase-3蛋白的表达，发挥了抗心肌细胞凋亡的作用。

综上，miR-92a在缺血再灌注后心肌组织和细胞中呈现高表达，下调miR-92a表达后能够减弱缺血再灌注引起的细胞凋亡，其作用机制可能与调控Bcl-2和酶切Caspase-3蛋白的表达有关。以miR-92a为靶点预防和减轻缺血/再灌注损伤等心血管疾病的研究提供新的方向和参考依据。