陆地棉新陆早45号体细胞胚胎发生及再生体系的建立

葛书娅，沈秋平，何积明，吕尊富，郑海彪，李飞飞

（浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江临安311300）

棉花是我国重要的经济作物，随着棉花基因工程和转基因育种的不断发展，陆地棉的组织培养和遗传转化技术已经被建立和完善[1]，转基因育种成为棉花育种较快捷有效的途径，转基因抗虫棉已经被广泛推广种植[2]，并带来了很好的经济效益。棉花的再生方式有器官发生和体细胞胚胎发生，其中体细胞胚胎发生再生的棉花转基因体系具有遗传稳定性好和嵌合体少的优点，常被用作棉花遗传转化的首选途径[3]。体细胞胚胎发生的再生体系的建立是棉花高效的遗传转化技术的基础[4-6]。但是，棉花胚胎发生的再生途径只在有限的陆地棉材料上获得了成功，迫切需要扩展不同基因型棉花再生体系。基于此，选取陆地棉品种新陆早45号下胚轴作为外植体，参考已经成功报道的愈伤组织诱导所需的激素，设计6种激素组合，找到新陆早45号胚轴段诱导愈伤组织的最佳激素组合，并进行胚性愈伤组织诱导，统计分化率，结合代谢胁迫诱导胚状体的形成，提高成苗率，进而获得再生小苗，缩短再生周期，建立并优化新陆早45号再生体系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1外植体。陆地棉品种新陆早45号的下胚轴。

1.1.2培养基。幼苗培养基（MS1）：1/2MS培养基。诱导愈伤组织培养基 （MS2）：MS＋0.75 g·L－1MgCl2＋30 g·L－1葡萄糖＋2.0 g·L－1植物凝胶＋激素组合 （表1）。诱导胚性愈伤组织培养基（MS3）：MS ＋1.9 g·L－1KNO3＋0.75 g·L－1MgCl2＋1.0 mg·L－1天冬酰胺＋2.0 mg·L－1谷氨酰胺＋30 g·L－1葡萄糖＋2.0 g·L－1植物凝胶。分化和成苗培养基（MS4）：MS-NH4NO3＋0.75 g·L－1MgCl2＋1.0 mg·L－1天冬酰胺＋2.0 mg·L－1谷氨酰胺＋30 g·L－1葡萄糖＋2.5 g·L－1植物凝胶。生根培养基（MS5）：MS＋0.1mg·L－1NAA（萘乙酸）＋0.75 g·L－1MgCl2＋30 g·L－1葡萄糖＋2.0 g·L－1植物凝胶。

表1 愈伤组织诱导激素组合Table 1 The hormone combinations of the callus inducing media mg·L－1

1.2 方法

1.2.1外植体的制备与愈伤组织的诱导。新陆早45号种子用75%（体积分数）酒精消毒30 s，30%（质量分数）H2O2消毒3～4 h，无菌水清洗3～4次，浸泡过夜，待露白后剥去种皮，接到幼苗培养基培养5～7 d。将下胚轴切成0.7～0.8 cm的小段，接种到愈伤组织诱导培养基MS2，按照每种激素组合设3个重复，每个重复包含30个下胚轴小段，每30 d继代1次，培养30 d左右，统计愈伤组织块数，并计算出愈率，出愈率＝胚轴两端伤口的出愈数/（茎段数×2）。

1.2.2胚胎发生和成苗。愈伤组织的直径达到3～5 mm，转接到MS3进行胚性愈伤组织诱导，约40 d在愈伤组织与培养基的接触面产生细颗粒状的胚性愈伤组织，将增殖的胚性愈伤组织转接在铺有滤纸的MS4上，诱导出现胚状体，进一步发育成苗。这个过程每20 d继代1次。分化率是产生胚性愈伤组织的愈伤组织在总愈伤组织中的占比。所有材料在温度25～27℃，光照强度2 000 lx，每天16 h光照/8 h黑暗的条件下进行培养。

1.2.3嫁接成活。待再生苗茎长2～3 cm时，将其接种到生根培养基上。经过约30 d的培养小苗会长出2～3片真叶以及一定量的根，最后采用劈接法嫁接使其成活[8]。

2 结果与分析

2.1 不同激素组合对新陆早45号愈伤组织诱导的影响

从表2可以看出，6种激素组合均能诱导产生愈伤组织，然而不同激素组合诱导的愈伤组织颜色和质地不同，出愈率也存在显著差异。在C2、C4和C6激素组合中，新陆早45下胚轴产生的愈伤组织呈绿色，大多质地坚硬（图1B和D），少部分偏疏松（图1F）。与C2、C4和C6激素组合相比，C1、C3和C5激素组合诱导的愈伤组织明显偏黄，结构也更疏松，生长状态更佳（图1A、C和D），出愈率也显著升高。C1和C5激素组合的出愈率分别为88.3%和92.2%，显著高于C3的81.1%，同时C1和C5诱导出的愈伤组织色泽和长势也要好于C3。因此，新陆早45下胚轴的愈伤组织诱导的适宜激素组合为C1和C5。

2.2 不同激素组合的愈伤组织分化率的比较

不同激素组合诱导的愈伤组织转移至MS3上诱导胚性愈伤组织，结果显示，不同激素组合诱导出的愈伤组织具有不同的分化能力 （表2）。C1诱导出的愈伤组织在MS3上增殖较快，培养约40 d后部分疏松黄绿色的愈伤组织与培养基的接合面会出现少量灰黄色略带红色、细粒状的胚性愈伤组织，这些胚性愈伤组织能进一步分化成苗，C1激素组合的分化率高达40.3%。C3和C5诱导的愈伤组织虽然在MS3上也增长较快，但是愈伤总体质量较C1差，分化率分别为11.6%和25.9%。激素组合C2、C4和C6诱导的愈伤组织增长缓慢，质地紧密坚硬，随后出现褐变，不能分化出胚性愈伤组织。因此，C1激素组合不仅能高效诱导愈伤组织，而且产生的愈伤组织质量最好，诱导胚性愈伤组织和分化出苗的比例高。

表2 不同激素组合对愈伤诱导效率的影响Table 2 Effects of various hormone combinations on callus inductionefficiency

2.3 新陆早45号再生体系的建立

图1 不同激素组合诱导的愈伤组织Fig.1 Callus induced by different hormone combinations

新陆早45号下胚轴在C1激素组合的培养基中培养7 d后开始膨大，30 d后胚轴段的两端出现明显的愈伤组织 （图2A），60 d后将直径为3～5 mm疏松、黄绿色的愈伤组织转接在MS3上进行胚性愈伤组织的诱导。在MS3上培养大约40 d，与培养基接触的愈伤组织出现黄色、细颗粒状的胚性愈伤组织（图2B），能分化的愈伤组织大部分会长出一些根状物，培养60 d后将增殖的胚性愈伤组织（图2C）继代到铺有滤纸的MS4培养基上。在MS4培养基上培养20 d左右出现少量胚状体（图2D），胚状体在MS4上进一步萌发成苗（图2E）。整个过程需要150 d左右。再生小苗通过生根培养后生根，但因无强韧根系而不适合直接移栽。因此，采用嫁接的方法使其成活（图2F）。总共嫁接了180棵小苗，最终成活151棵，嫁接成活率为83.9%。

3 讨论

棉花胚胎再生的组织培养体系的建立受限于基因型的影响，不同基因型对棉花体细胞胚胎发生和植株再生具有决定性作用。目前，在棉属的40余个种中仅克劳茨基棉、戴维逊氏棉、陆地棉、海岛棉和亚洲棉这5个棉种诱导获得了体细胞胚和再生植株[9]。在陆地棉中也仅限于部分基因型建立了胚胎发生的再生体系，且品种间的再生能力差异明显。新陆早45号为我国棉花主产区新疆地区的主要推广品种，对其再生体系的建立拓宽了陆地棉再生的基因型，也为棉花基因工程遗传育种的研究奠定了基础。从已报道的研究结果来看，陆地棉的胚胎发生和再生建立需要较长周期，一般6～10个月。焦天奇等[10]利用新陆早42号进行体细胞胚胎发生和植株再生，耗时约140 d；陈天子等[5]报道的新陆早33号从诱导愈伤组织到再生约需180 d。本试验为了提高体细胞胚再生率，缩短再生时间，在胚状体诱导阶段，去除NH4NO3， 将植物凝胶含量从 2.0 mg·L－1提高到2.5 mg·L－1，同时在培养基表面铺了1层无菌滤纸，造成干旱胁迫，抑制胚性愈伤组织从培养基上吸收养分，降低胚性愈伤组织增殖速度，迫使胚性愈伤组织萌发胚状体以及成苗。一些胚性愈伤组织发生质的改变，形成胚状体；一些胚性愈伤组织则褐化死亡。本试验建立了新陆早45号的胚胎发生再生体系，从诱导愈伤组织到获得再生小苗历经约150 d，在一定程度上缩短了再生时间。

图2 新陆早45号植株再生的流程Fig.2 Plant regeneration process of Xinluzao 45

众所周知，植物激素是影响棉花愈伤组织诱导和植株再生的1个重要因素。在棉花下胚轴的愈伤组织的研究中常用的激素有2，4-D、NAA和IBA等生长素和KT和6-BA等细胞分裂素[11-15]。其中 0.1 mg·L－12，4-D 诱导的愈伤组织，具有出愈率高、愈伤组织状态好等优点。本试验对新陆早45号下胚轴愈伤组织的诱导和再生也验证了这一点。其中下胚轴在 C1 （0.1 mg·L－12，4-D+0.1 mg·L－1KT）的激素组合下诱导出的愈伤组织不仅质量最好，而且能够高效分化出胚性愈伤组织。陈天子等[5]对4个新疆主栽品种（新陆中20、新陆早23、新陆早33和03298）的下胚轴愈伤组织诱导的结果显示 0.02 mg·L－1或 0.1 mg·L－1KT和 0.1 mg·L－12，4-D组合的诱导效果最佳，且都有利于胚性愈伤组织的产生。刘丽等[16]对新陆早32号、33号的体细胞胚胎发生和植株再生的比较研究发现，不同基因型的分化速度与激素组合和质量浓度关系密切，其中基因型新陆早33号在含 0.1 mg·L－12，4-D+0.1 mg·L－1KT 培养基上的分化速度较快。对新陆早42号体细胞胚发生和植株再生的研究也显示0.1mg·L－12，4-D＋0.1 mg·L－1KT激素组合诱导的初生愈伤组织在后续的培养中可出现胚[10]。可见C1（0.1 mg·L－12，4-D＋0.1 mg·L－1KT） 激素组合对诱导部分基因型棉花的愈伤组织比较有效。本研究中虽然下胚轴在 C3（0.1 mg·L－12，4-D＋0.5 mg·L－16-BA）和 C5 （0.1 mg·L－12，4-D＋0.5 mg·L－1IBA＋0.1 mg·L－1KT）的MS2培养基上也均能诱导出黄绿色或淡黄色、质地疏松的愈伤组织，但是从胚性愈伤组织诱导阶段来看，C1诱导出的愈伤组织体细胞胚分化率最高，更加有利于植株再生。从已报道的棉花体细胞胚发生的研究来看，在胚性愈伤组织诱导阶段，外源激素或者无机盐会造成愈伤组织向非配型愈伤组织逆转生长[17]。因此，陆地棉不同的基因型均在无激素的培养基上进行胚性愈伤组织的诱导。本研究通过提高培养基中NO3－/NH4＋比例，有助于胚性愈伤诱导、胚状体的形成以及分化成苗。上述研究结果为进一步开展新陆早45的遗传转化工作奠定了基础。

4 结论

本研究通过设置6种不同激素组合，诱导新陆早45号下胚轴产生的愈伤组织及胚性愈伤组织，筛选到 C1（0.1 mg·L－12，4-D ＋ 0.1 mg·L－1KT）为诱导愈伤组织的最佳激素组合，愈伤组织在KNO3加倍的培养基上，分化出胚性愈伤组织。在去掉 NH4NO3、植物凝胶由 2.0 mg·L－1增加到2.5 mg·L－1和铺1层无菌滤纸的培养基上，胚性愈伤组织进一步形成胚状体，成苗。整个过程历经150 d左右。本研究建立了以下胚轴为外植体的新陆早45号的再生体系，拓展了陆地棉再生的基因型，对促进新疆棉花转基因育种具有一定的意义。