不同遗传背景转基因抗虫棉Bt蛋白表达与氮代谢关系研究

赵红霞，王士杰，朱继杰，李妙，王国印

（河北省农林科学院粮油作物研究所/河北省作物遗传育种实验室，石家庄050035）

利用基因工程技术转入棉花的Bt（苏云金芽孢杆菌）基因，可在棉花各组织器官中高效表达，合成对鳞翅目害虫具有高效毒杀作用的蛋白[1]。实践证明，转Bt基因棉花杀虫活性高，有效控制时间长，在种植过程中可有效减少用药量，同时与其他防治措施的兼容性好[2-3]。因此，转基因抗虫棉在国内外迅速推广。

随着转Bt基因抗虫棉的大面积推广，越来越多的研究证实其抗虫性在棉花生育过程中表现不稳定，不同阶段抗虫性差异较大，一般是生育前期好于后期，营养器官好于生殖器官。不同转基因抗虫棉品种的杀虫蛋白表达量也存在较大差异[4]，且遗传背景对Bt杀虫蛋白的表达也具有较大影响[4-5]。

转Bt基因棉株中杀虫蛋白表达量的动态变化与氮素代谢直接相关[6-7]。目前，关于环境和栽培措施引起棉花氮代谢改变对棉花杀虫蛋白表达量影响研究较多，对不同遗传背景转基因棉花杀虫蛋白表达量与氮代谢关系研究较少。本试验从与Bt蛋白合成密切相关的氮代谢入手，以转基因抗虫棉稳定新品系、陆陆杂交种为研究对象，以中棉所45为对照，研究不同遗传背景转基因棉花杀虫蛋白表达量与氮代谢关系，为筛选高抗虫棉花品种提供借鉴和参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料共41份，序号A01～A13为利用农杆菌介导法转化冀668获得的转Bt基因稳定品系B1～B13，A14～A26为通过常规杂交、系统选育获得的冀棉20×97G1（GK12系选）后代稳定品系J1～J13，A27～A29为自育光籽材料G1～G3，A30～A32 为自育彩棉 C1～C3，A33～A34为03～1314×零式果枝自交8代后的稳定品系 D1～D2，A35为 8501×9685后代稳定品系，A36 为（J11×冀 668）F1，A37 为（B12×鄂荆55173）F1，A38 为（B13×R1）F1，A39 为新棉 33B，A40为DP99B，A41为对照中棉所45。

1.2 试验方法

1.2.1试验设计。2015—2016年在河北省农林科学院粮油作物研究所堤上试验站种植。2015年4月26日播种，2016年4月25日播种。随机区组设计，重复2次，2行区，行长7.4 m，每行种植24株，区组两边设保护行，常规栽培管理。

1.2.2取样时期和方法。Bt蛋白检测取样：在棉花苗期（4～6片真叶），2015年6月4日、2016年6月4日每个小区随机取15株顶部第一片完全展开叶；盛蕾期（第4果枝现蕾），2015年6月25日、2016年6月28日每个小区随机取15株顶部第一片完全展开叶和1个幼蕾（直径0.5～0.7cm）；结铃盛期（第4果枝结铃），2015年7月28日、2016年7月22日每个小区随机取15株顶部第一片完全展开叶和1个幼铃（直径约1.0cm）。鲜样用液氮冷冻后，存放于－80℃超低温冰箱保存。

氮代谢生理指标测定取样：在上述取样的同时间，每个小区随机取15株正常棉株的功能叶片（倒四叶），鲜样用液氮冷冻后，带回室内剪一半鲜样存放于－80℃超低温冰箱用于游离氨基酸和可溶性蛋白测定，另一半用烘箱在105℃杀青30 min后，在80℃下烘干至质量恒定用于全氮测定。

1.2.3Bt毒蛋白检测。采用Envirologix公司生产的酶联免疫试剂盒测定Bt毒蛋白含量。

1.2.4氮代谢生理指标测定。用茚三酮比色法测游离氨基酸含量，用考马斯亮蓝比色法测可溶性蛋白含量，用凯氏定氮法测全氮含量。

2 结果与分析

2.1 不同遗传背景的抗虫棉品系Bt蛋白表达量差异

41份不同遗传背景的转基因抗虫棉品系苗期幼叶、蕾期幼叶、蕾期幼蕾、铃期幼叶和铃期幼铃的Bt蛋白表达量测定结果作Duncan’s新复极差检验（表1），发现苗期幼叶、蕾期幼叶、蕾期幼蕾、铃期幼铃、铃期幼叶之间均存在极显著差异。Bt表达量的高低顺序：苗期幼叶最高，其次是蕾期幼叶、蕾期幼蕾、铃期幼铃、铃期幼叶（图1），表明随着棉花的生长发育，幼叶中Bt蛋白表达量降低。生殖器官中幼蕾的含量高于幼铃。通过对2年测试数据进行方差分析发现，不同遗传背景的品系间、年份间、生长时期以及各因子互作间均存在极显著差异，表明Bt蛋白表达受环境和遗传背景影响较大。

对40份不同遗传背景的抗虫棉品系与对照中棉所45 Bt蛋白表达量差异水平作分类统计（表2），苗期幼叶、蕾期幼叶、铃期幼叶Bt蛋白表达量显著高于对照的材料分别达到62.5%、62.5%和52.5%，而在铃期幼铃中Bt蛋白表达量显著高于对照的材料只占12%，在蕾期幼蕾中显著高于对照的材料则没有。

表1 不同生长时期棉花Bt蛋白表达量Duncan’s新复极差检验Table 1 Duncan’s test of Bt cotton protein contents at different growth periods

图1 不同生长时期棉花Bt蛋白表达量Fig.1 Contents of the Bt protein in cotton at different growth periods

2.2 不同遗传背景的抗虫棉氮代谢指标变化

2.2.1全氮含量变化。主茎功能叶中全氮含量蕾期最高，其次是铃期、苗期（图2），与Bt蛋白表达量变化不一致。对不同时期主茎功能叶全氮含量做Duncan’s新复极差检验发现，蕾期全氮含量与铃期和苗期之间达显著和极显著差异，苗期和铃期之间无显著差异。

2.2.2游离氨基酸含量变化。主茎功能叶中游离氨基酸含量变化趋势与Bt蛋白表达量变化一致，在苗期、蕾期、铃期中呈逐渐下降趋势（图3），且各时期间达极显著差异。

2.2.3可溶性蛋白含量变化。主茎功能叶中可溶性蛋白含量以苗期最高，其次是蕾期，铃期含量最低（图4），与Bt蛋白表达量变化一致，且各时期间达极显著差异。

2.3 Bt蛋白表达量与氮代谢相关性

将41份抗虫棉Bt蛋白表达量与氮代谢相关指标进行相关分析发现，营养器官中Bt蛋白表达量与可溶性蛋白和游离氨基酸含量呈极显著正相关，相关系数均为0.86；与全氮含量相关性不显著。生殖器官中Bt蛋白表达量与可溶性蛋白含量呈极显著正相关（相关系数为0.78），与游离氨基酸和全氮含量分别呈显著和极显著正相关（相关系数分别为0.41和0.45）。

表2 不同遗传背景的抗虫棉品系与对照中棉所45 Bt蛋白表达量差异比较Table 2 Comparation of Bt protein contents between insect-resistant cotton lines and CCRI 45（control）

图2 不同棉花品系不同时期全氮含量Fig.2 Contents of total nitrogen at different growth periods among the cotton lines

图3 不同棉花品系不同时期游离氨基酸含量Fig.3 Contents of free amino acid in different cotton lines at different growth stages

图4 不同棉花品系不同时期可溶性蛋白含量Fig.4 Soluble protein contents of different cotton lines at different growth stages

营养器官和生殖器官中Bt蛋白表达量均与可溶性蛋白含量高度正相关，进一步分析发现，利用农杆菌介导转化冀668获得的转Bt基因稳定品系中，可溶性蛋白含量由苗期至蕾期、蕾期至铃期均匀下降的品系，中后期的Bt蛋白表达量超过对照，如B8（A08）等品系。苗期至蕾期可溶性蛋白含量下降幅度较大的品系，中后期Bt蛋白表达量低于对照，尤其是幼蕾幼铃中Bt蛋白含量低，如 B1（A01）、B2（A02）等品系（表 3）。

表3 各棉花品系Bt蛋白含量差值与可溶性蛋白含量差值关系Table 3 Trends of Bt protein content differences and soluble protein content differences among the cotton lines

表3 （续）Table 3 （Continued）

在冀棉20×97G1（GK12系选）后代稳定品系 J1～J13（A14～A26）中也出现相似规律，可溶性蛋白含量由苗期至蕾期、蕾期至铃期均匀下降的品系，中后期Bt蛋白表达量高于对照，如J13（A26）、J7（A20）。不同点是 J1～J12（A14～A25）中可溶性蛋白含量下降幅度较大时期出现在蕾期至铃期，导致后期幼铃中Bt蛋白表达量显著低于对照，如 J12（A25）、J5（A18）等品系。

在光籽材料、彩棉、其他组合和杂交F1中，也出现相似规律。

3 讨论与结论

本试验以不同遗传背景的转基因抗虫棉为研究对象，结果表明不同抗虫棉之间杀虫蛋白表达量存在较大差异，且存在时空差异，一般生育前期大于后期，营养器官大于生殖器官，这与前人研究结果一致。谷淇深研究表明抗虫棉的抗虫性与Bt蛋白表达量高度正相关[4]。与对照中45相比，本研究测试材料大部分幼叶中Bt蛋白表达量高于对照，幼蕾、幼铃中Bt蛋白表达量显著低于对照。因此，选育抗虫棉品种过程中，在考虑苗期幼叶、蕾期幼叶、铃期幼叶Bt蛋白表达量高的前提下，重点将幼蕾、幼铃中Bt蛋白表达量作为重要参考指标。

不同遗传背景的转基因抗虫棉可溶性蛋白和游离氨基酸含量从苗期到蕾期、铃期呈依次下降的趋势，且各时期存在极显著差异；可溶性蛋白含量与Bt蛋白表达量呈高度正相关关系，相关系数0.86，当可溶性蛋白含量从苗期至蕾期、蕾期至铃期均匀下降时，Bt蛋白在中后期生殖器官中的表达量高。因此，可溶性蛋白检测可作为筛选高Bt蛋白表达量棉花品种的指标，为培育高抗虫品种提供重要参考。