花椰菜雪剑4号合子胚增殖体系的建立

许丁帆，刘艳军*，丁鼎，季核亮，黄俊轩，武春霞，李建科

(1.天津农学院 园艺园林学院，天津 300384；2.天津市耕耘种业股份有限公司，天津 300408)

花椰菜别名花菜、菜花，是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种，营养价值高，风味鲜美，适应性广，是我国广泛种植的主要蔬菜之一[1]。我国是世界上花椰菜种植面积最大、总产最高、发展最快的国家[2]。花椰菜具有明显的杂种优势，利用杂种优势是花椰菜育种的重要途径之一[3]。生产上利用杂种优势已选育出较多的花椰菜，但人工杂交制种需要消耗大量的人力物力，严重阻碍花椰菜育种的发展。且杂交育种会受到季节气候、母株材料等因素的影响，选育一个新品种往往需要6～8 a，育种周期较长[4]。

人工种子能够快速固定杂种优势，大大缩短育种年限，使得优良性状快速得以应用。我国在人工种子的研制和研究上取得了较快的进展，其研究主要集中在仙茅[5]、垂盆草[6]、杜鹃[7]、大花蕙兰[8]等药用植物和观赏植物上，关于蔬菜人工种子的研究相对较少，蔬菜中胡萝卜、芹菜、莴苣、姜等人工种子已有应用[9]。关于花椰菜人工种子的研究少有报道，花椰菜人工种子的研制可省去人工去雄这一环节，快速固定F1代优良性状，且不受季节影响，能够有效缩短花椰菜育种年限、降低人工成本，具有较强的应用价值。制作人工种子的关键是人工种胚的研制，胚状体、愈伤组织、不定芽等是人工种胚的理想材料[10]。本研究采用花椰菜成熟种子为外植体，直接诱导产生胚状体，并通过胚状体增殖的方式获得大量稳定均一的胚状体，为人工种子胚的研制奠定基础，从而克服采用体细胞直接诱导胚状体效率低和遗传稳定性差的缺点。

1 材料与方法

1.1 材料

供试花椰菜种子品种为雪剑4号，由天津市耕耘种业有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 花椰菜种子的消毒

选取颗粒饱满的花椰菜种子，用体积分数为70%的乙醇溶液润湿种子表面，再用体积分数为40%的安替福民溶液消毒10 min，无菌水冲洗3次，每次冲洗5 min。冲洗后用无菌水浸泡2 h，备用。

1.2.2 花椰菜胚状体的诱导

在无菌滤纸上，用解剖刀将种子表皮损害并刻伤子叶、下胚轴，分别接种到不同花椰菜胚状体诱导培养基上。胚状体诱导培养基采用MS为基础培养基，分别添加不同浓度的BA、2,4-D、NAA和蔗糖，采用7.0 g·L-1琼脂粉固化，高压灭菌前调节pH至5.8。每个处理接种5瓶，每瓶接种6粒种子，重复3次。

培养条件。于(24±2)℃条件下，采用相同培养基每15 d继代培养1次，避光培养45 d，然后移至连续光照条件下培养，光照强度为2 000 lx，培养温度不变，再经2次继代培养后(继代周期15 d)，统计每种培养基上外植体的诱导情况。胚状体的判断采用显微观察及胚状体萌发试验的方法进行确定，即将诱导出的胚状体放到MS培养基上，经过短时间培养可很快获得再生植株。

1.2.3 花椰菜胚状体的增殖培养

诱导出的花椰菜胚状体呈聚合块状，用镊子将其分成约3 mm见方的颗粒，转接到胚状体增殖培养基上进行增殖培养。增殖培养基以MS为基础培养基，分别添加不同浓度配比的2,4-D与BA，附加7.0 g·L-1琼脂粉、30.0 g·L-1蔗糖，pH值5.8。重复3次，每处理接种5瓶，每瓶接种5块胚状体颗粒。培养条件为连续光照，光照强度为2 000 Lx，培养温度为(26±2)℃。处理每20 d继代培养1次，60 d后统计每种增殖培养基获得花椰菜胚状体的生长情况。

2 结果与分析

2.1 胚状体诱导

将花椰菜种子刻伤后，经过暗培养阶段，部分种子吸水膨胀，有的种子子叶长出，有的种子下胚轴长出；将其转移至光照培养条件后，部分种子子叶或下胚轴附近出现小的凸起，再经1次继代培养，凸起增大，逐渐出现颗粒状诱导物，经镜检和萌发试验确定部分培养基上的诱导物为胚状体。

由表1可知，当培养基中加入2.0 mg·L-1BA和2.0 mg·L-12，4-D时，仅能诱导产生愈伤组织，且愈伤组织结构松散，生长速度快，镜检观察此类愈伤组织多为液泡较大的薄壁细胞，一般很难诱导产生胚状体；当培养基中加入4.0 mg·L-1BA和2.0 mg·L-12，4-D时，外植体表面产生质地较硬、结构紧密的绿色愈伤组织，镜检发现此类愈伤组织已经组织化，内部出现维管组织。不断提高培养基中BA的浓度，当BA≤8.0 mg·L-1时，胚状体诱导率随着BA浓度的增加而提高，但胚状体结构紧密、生长速度较慢；当BA浓度>8.0 mg·L-1，胚状体诱导率降低，且胚状体玻璃化严重。为此，试验在8.0 mg·L-1BA的基础上附加了少量的NAA，诱导出的胚状体结构松散且生长速度较快，但此时胚状体诱导率较低。为了获得较高的胚状体诱导率和高质量的胚状体，试验调节培养基渗透压，当采用8%蔗糖时，花椰菜种子胚状体诱导率显著提高，达43.33%，同时胚状体结构松散、生长速度较快，在短时间内生长稳定。综上试验结果，选择MS+8.0 mg·L-1BA+2.0 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-1NAA+8%蔗糖培养基，可获得理想的花椰菜胚状体。

表1 花椰菜在不同培养基上胚状体诱导结果

2.2 球形胚继代增殖培养

将诱导出的胚状体继代培养于MS+8.0 mg·L-1BA+2.0 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-1NAA+8%蔗糖上，胚状体出现玻璃化现象，且结构紧密。为此，调整培养基激素与蔗糖浓度，在新的胚状体增殖培养基上进行增殖培养，经过2次继代培养后不同培养基上胚状体增殖情况明显不同。

由表2可知，在培养基中单独使用一定浓度BA时，花椰菜胚状体结构变得紧密，并随着继代次数的增加，胚状体不再具备发育成苗的能力。当BA浓度为4.0 mg·L-1时，胚状体玻璃化现象严重，最终褐化死亡。当在培养基中单独使用2,4-D时，胚状体上出现愈伤组织，并且随着2,4-D浓度增加，愈伤组织生长速度加快，结合镜检观察这些愈伤组织均为含大液泡的薄壁细胞。当培养基中BA与2,4-D混合使用时，情况变得较为复杂，这主要取决于二者的比值。当采用较高的BA/2,4-D比值时，胚状体保持较好，并在适宜的浓度下可以稳定增殖；当BA/2,4-D比值较低时，胚状体不能增殖并逐渐丧失发育能力，逐渐转变成愈伤组织。因此，选择MS+4.0 mg·L-1BA+0.5 mg·L-12,4-D+3%蔗糖的培养基进行花椰菜胚状体增殖的效果最好。

表2 不同植物生长调节剂对花椰菜胚状体增殖的影响

3 讨论

植物体胚发生主要有两种途径：一种为直接发生途径，即直接在外植体上不经愈伤组织阶段形成胚状体，其来源细胞可以是外植体表皮、亚表皮、合子胚等；另一种是在外植体上诱导胚性愈伤组织，再由胚性愈伤组织诱导胚状体，即间接发生途径[11-12]。通过不同体胚发生途径获得的胚状体在遗传稳定性方面差异较大。一般间接发生途径相对直接发生途径容易，但直接发生途径具有速度快、培养程序简单的特点，同时还能避免间接发生途径中由于经愈伤组织阶段体细胞无性系变异频率较高的特点[13]。为此，本试验选择花椰菜成熟的合子胚为外植体，直接诱导产生胚状体。其主要优势为，花椰菜成熟种子本身含有一定数量的胚性细胞，相对于成熟组织细胞直接诱导胚状体容易，其原因是胚性细胞实际没有经脱分化和再分化的环节，而是由胚性细胞直接发育成胚状体。如果采用体细胞进行胚状体的诱导，必须使得体细胞脱分化后再次转变为分生组织细胞，然后进一步发育成胚状体，这一过程，受植物基因型、生理状态等影响较大培养条件和营养供应较难摸索；同时，采用合子胚为外植体直接诱导胚状体，可避免细胞在脱分化与再分化过程中因使用大量外源激素，尤其是高浓度2，4-D的使用发生的遗传变异。因此，选择含胚性细胞的外植体以直接发生途径获得的胚状体是人工种胚的理想材料。

人工种子胚的分割是人工种子制作的关键步骤之一，采用松散型的人工种胚可减少分割时造成的机械损伤，理想的人工种胚材料应该是松散型的，而胚状体增殖一般都会形成难以分离的较大颗粒，在制作人工种子胚时容易造成机械损伤，从而导致种子的出芽率下降现象。本试验为诱导理想的松散型花椰菜人工种子胚，通过在培养基中加入少量2，4-D的方式，获得结构松散的胚状体聚集团。但需要注意一定采用较低浓度的2，4-D。有研究表明，2，4-D易引起培养物发生染色体变异[14]。同时，试验为获得稳定增殖且保持松散结构的胚状体，研究了不同BA与2，4-D比值对胚性材料增殖的主要影响。结果显示，采用较高浓度BA和低浓度2，4-D对于胚状体增殖培养较为理想。普遍认为，BA有利于胚状体的增殖[15-16]，可维持细胞增殖的趋势，是诱导胚状体产生次生胚状体的主要因素，这与初步诱导胚状体时采用8.0 mg·L-1BA的原理相同，但持续高浓度的BA也会导致次生胚状体生长速度过快，胚状体老化严重，这时配合使用一定浓度的2，4-D，可适度减缓胚性增殖这一过程，使得次生胚在形成过程中容易产生外部皮层结构，从而容易从母体上分离。

本试验为获得理想的花椰菜人工种子胚，选用花椰菜成熟种子为外植体，在高浓度BA和高浓度蔗糖配合使用条件下，获得花椰菜初生胚状体，然后再用含较高浓度BA与低浓度2，4-D的胚状体增殖培养基，获得了生长稳定、结构松散的胚状体培养体系，这对于花椰菜人工种子的研制具有重要意义，同时也为其他植物品种的人工种子的研制提供参考。关于花椰菜胚状体同步化控制、萌发性试验及其包埋与贮藏技术有待进一步研究。