康媛颗粒HPLC指纹图谱的建立及主要成分含量测定

郑艳萍 田荣 张金龙 金俊杰 蔡宝昌

摘要：目的 建立康媛颗粒HPLC指纹图谱，同时检测芍药苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷4个成分的含量。方法 采用YMC-Pack-ODS-A C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流动相为0.05%磷酸水-乙腈，梯度洗脱，流速0.6 mL/min，柱温30 ℃。结果 10批康媛颗粒的指纹图谱相似度较高，确定9个共有色谱峰。芍药苷、阿魏酸、甘草苷、陈皮苷含量分别在1.102～11.02 ?g（r=1）、0.201～2.01 ?g（r=0.999 5）、0.270～2.70 ?g（r=0.999 8）、0.102～1.02 ?g（r=1）范围内与峰面积呈良好的线性关系，仪器精密度良好，供试品溶液在24 h内基本稳定。结论 本研究建立的康媛颗粒指纹图谱及4个成分含量测定方法简便、稳定、准确可靠，可用于康媛颗粒的质量控制。

关键词：康媛颗粒；芍药苷；阿魏酸；甘草苷；橙皮苷；高效液相色谱法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.021

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）12-0088-04

Abstract： Objective To establish HPLC fingerprints of Kangyuan Granules and determine the contents of peoniflorin， ferulic acid， glycyrrhizin and hesperidin. Methods The samples were separated by the chromatographic column of YMC-Pack-ODS-A C18 （250 mm × 4.6 mm， 5 ?m）. The mobile phase was acetonitrile-0.05% phosphoric acid aqueous solution and gradient elution. The flow rate was 0.6 mL/min， and the column temperature was at 30 ℃. Results The fingerprints of 10 batches of Kangyuan Granules had higher similarity and nine common chromatogram peaks were determined. The contents of peoniflorin， ferulic acid， glycyrrhizin and hesperidin were among the ranges of 1.102–11.02 ?g （r=1）， 0.201–2.01 ?g （r=0.999 5）， 0.270–2.70 ?g （r=0.999 8） and 0.102–1.02 ?g （r=1）， respectively， which showed good linear relationship with the peak area. The instrument precision was good and the sample solution was basically stable within 24 hours. Conclusion The method of Kangyuan Granules fingerprints and the content determination of four components are simple， stable， accurate and reliable， which can be used for the quality control of Kangyuan Granules.

Keywords： Kangyuan Granules； paeoniflorin； ferulic acid； glycyrrhizin； hesperidin； HPLC

康媛颗粒是由黄芪、柴胡、当归、白芍、甘草、陈皮等11味中药制成的颗粒剂，具有舒肝解郁、理气止痛、养血调经功效。该方出自《太平惠民和剂局方》，方中黄芪补气升阳、生津养血，当归补血活血、调经止痛、润燥滑肠，柴胡和解表里、疏肝升阳，香附理气解郁、调经止痛。诸药合用，对肝郁气滞引起的胸胁脘腹胀痛、消化不良、月经不调、经闭痛经、寒疝腹痛、乳房胀痛具有很好的疗效。

康媛颗粒目前执行《卫生部药品标准·中药成方制剂》（WS3-B-3988-98），该标准产品检验只规定了性状、鉴别、检查3项内容，未对其主要成分进行定性和定量检测，导致市场上该产品质量参差不齐，影响临床疗效。因此，本研究采用中药指纹图谱技术[1]建立康媛颗粒HPLC指纹图谱，同时对制剂中芍药苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷4种成分进行含量测定[2-3]，从而对康媛颗粒进行质量控制，并为该制剂质量标准的提高奠定基础。

1 仪器与试药

Shimadzu LC-20AB高效液相色谱系统（包括在线脱气机、自动进样器、二极管阵列检测器、柱温箱），日本岛津公司；BP121S电子分析天平，SARTORIUS；KQ5200DB型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

10批康媛颗粒样品分别来自南京海昌中药集团（H1、H2、H3、H4、H5）和黑龙江济仁药业有限公司（J6、J7、J8、J9、J10）。芍药苷对照品（批号170109）、阿魏酸对照品（批号161204）、甘草苷对照品（批号161216）、橙皮苷对照品（批号161230），含量均大于98%，南京森贝伽生物科技有限公司。色谱纯乙腈，美国天地公司；石油醚、甲醇、磷酸，南京化學试剂有限公司；屈臣氏纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用YMC-Pack-ODS-A C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相为0.05%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～10 min，5%～10%B；10～20 min，10%～15%B；20～40 min，15%～21%B；40～60 min，21%～25%B；60～80 min，25%～30%B）；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃；流速：0.6 mL/min；进样量：10 ?L。

2.2 对照品溶液的制备

取一定量的芍药苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷对照品，精密称定，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并定容至刻度，最终得到浓度分别为1102、201、270、102 ?g/mL的混合对照品贮备液。

2.3 供试品溶液的制备

取康媛颗粒样品17 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密吸取40 mL石油醚溶液，超声（功率250 W，频率100 kHz）30 min，过滤，弃去滤液，残渣吹干，精密加入甲醇溶液20 mL，称定质量，再超声（功率250 W，频率100 kHz）30 min，冷却后称定质量，用甲醇溶液补足减失的质量，取续滤液，过0.45 ?m微孔滤膜，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 指纹图谱及含量测定方法的建立

取10批康媛颗粒样品，按“2.3”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件进样分析，色谱图见图1。根据10批康媛颗粒指纹图谱分析及数据计算，结果确定共有峰9个，见图2。

2.4.2 线性关系考察

取“2.2”项下制备的混合对照品贮备液800、600、400、200、100 ?L，分别置于1 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到不同浓度混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，并以峰面积和待测组分对照品质量进行线性回归，结果见表1。

2.4.3 精密度试验

精密吸取“2.3”项下制备的样品编号为H1的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，其1～9号共有峰相对保留时间RSD分别为0.35%、0.13%、0.11%、0.05%、0.06%、0.05%、0.06%、0.07%、0.09%，相对峰面积RSD分别为1.36%、0.41%、0.97%、1.93%、1.99%、1.39%、0.56%、1.26%、0.69%，表明仪器的精密度良好。

2.4.4 稳定性试验

取“2.3”项下制备的样品编号为H1的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样进行测定，1～9号共有峰相对保留时间RSD分别为0.82%、0.89%、0.86%、0.64%、0.87%、0.43%、0.44%、0.34%、0.30%，峰面积RSD分别为1.40%、2.76%、2.05%、1.57%、1.93%、1.05%、1.89%、2.37%、0.40%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.5 重复性试验

精密称取编号为H1的样品17.0 g，共6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，其主要共有峰相对保留时间RSD均小于0.80%，相对峰面积RSD均小于2.97%，表明方法的重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验

取“2.4.4”项下含量确定的康媛颗粒样品（H1）6份，每份约8.5 g，精密称定，精密加入与已知含量相当的芍药苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分析，计算芍药苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷的平均加样回收率，结果见表2～表5。

2.4.7 样品含量测定

取康媛颗粒样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件检测芍药苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷含量，结果见表6。

2.4.8 指纹图谱相似度分析

将10批康媛颗粒样品HPLC色谱图及数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004 A）》，使用对照品作参照，比较分析各样品中共有峰的相对保留时间及相对峰面积数据。依据参照色谱峰，将各样品色谱图进行自动匹配，进行指纹图谱比对，对10批康媛颗粒HPLC指纹图谱进行相似性评价。使用对照HPLC指纹图谱生成共有色谱峰模式，计算10批康媛颗粒样品共有色谱峰之间的相似度，结果表明，10批康媛颗粒样品与对照指纹图谱具有较好的相似性，说明所建立的康媛颗粒HPLC指纹图谱方法能够较好地反映不同厂家及批次康媛颗粒的质量。结果见表7。

3 讨论

目前，康媛颗粒样品分析多采用HPLC对其中的芍药苷或阿魏酸等单一指标成分进行含量测定[4-7]，但康媛颗粒中的阿魏酸等成分不稳定，采用单一提取方法处理的样品杂质峰较多，分离效果不好。本试验采用多种提取方法处理样品后进行分析，结合指纹图谱所得色谱峰，最终确定先采用石油醚进行脱脂处理，弃去滤液，残渣用吹风机的冷风吹干，再使用甲醇超声提取的方法。此方法可使康媛颗粒主要成分色谱峰达到较好的分离效果。

目前市售康媛颗粒质量标准不统一，而且由于不同批次康媛颗粒的药材来源、炮制、生产工艺等因素导致其质量参差不齐。对康媛颗粒主要成分芍药苷、橙皮苷的含量测定方法有薄层扫描法[8]、紫外分光光度法等。本试验通过中药指纹图谱技术对不同批次的康媛颗粒进行相似度分析，并同时对其中的芍药苷、阿魏酸、甘草苷、橙皮苷4种主要成分进行含量测定，方法学考察结果表明，本研究建立的康媛颗粒指纹图谱及含量测定方法简便、准确，可用于康媛颗粒的质量控制。

参考文献：

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[2] 刘利军，朱又红，龚云.康媛颗粒质量标准研究[J].海峡药学，2009， 21（9）：50-52.

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[4] 潘萍，潘金火.康媛颗粒质量标准研究[J].中国中医药信息杂志， 2007，14（10）：42-44.

[5] 孙立华，吴爱英，张春辉.康媛颗粒质量标准的研究[J].中国药品标准， 2006，7（1）：66-68，42.

[6] 刘仲.HPLC法测定康媛颗粒中芍药苷的含量[J].安徽医药，2005，9（1）：41-42.

[7] 孙立华，吴爱英，张春辉.高效液相色谱法测定康媛颗粒中阿魏酸的含量[J].中国药事，2003，17（12）：36-37.

[8] 李辉.康媛顆粒质量标准研究[J].黑龙江医药，2005，18（4）：257-259.