玉屏风散对变应性鼻炎模型大鼠TLR4/NF—κB信号通路的影响

林甦 黄敬之

摘要：目的 观察玉屏风散对变应性鼻炎（AR）鼻黏膜上皮细胞TLR4/NF-κB信号通路的影响，探讨其作用机制。方法 采用卵清白蛋白致敏建立AR大鼠模型。实验大鼠随机分为正常组、模型组和玉屏风散低、中、高剂量组。采用AR行为学指标进行评分，HE染色观察大鼠鼻黏膜形态；ELISA测定大鼠血清白细胞介素（IL）-4、IL-5、IL-10、免疫球蛋白E（IgE）和干扰素-γ（IFN-γ）含量，Western blot、RT-PCR檢测大鼠鼻黏膜Toll样受体4（TLR4）和核因子（NF）-κB p65蛋白和基因的表达。结果 与正常组比较，模型组大鼠血清IL-4、IL-5、IgE含量显著升高，IL-10和IFN-γ含量显著降低（P<0.01），鼻黏膜TLR4、NF-κB p65蛋白和基因表达显著升高（P<0.01）；与模型组比较，玉屏风散中、高剂量组大鼠血清IL-4、IL-5、IgE含量显著降低，IL-10和IFN-γ含量显著升高（P<0.05，P<0.01），鼻黏膜TLR4、NF-κB p65蛋白和基因表达显著降低（P<0.05，P<0.01）。结论 玉屏风散可能通过调节模型大鼠TLR4/NF-κB信号通路及相关炎性因子，而起到治疗AR的作用。

关键词：变应性鼻炎；玉屏风散；TLR4/NF-κB信号通路；免疫因子；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.013

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）12-0048-05

Abstract： Objective To investigate the effects of Yupingfeng Powder on TLR4/NF-κB signaling pathway in allergic rhinitis nasal epithelial cells； To discuss its mechanism of action. Methods AR rat models were established by using ovalbumin sensitization. Experimental rats were randomly divided into normal group， model group and Yupingfeng Powder low-， medium- and high-dosage groups. After modeling， the AR behavioral index was used for scoring， and nasal mucosa by HE staining were observed. Serum IL-4， IL-5， IL-10， IgE and IFN-γ levels in rats were detected by ELISA. Western blot and RT-PCR were used to detect proteins and gene expressions of Toll-like receptor 4 （TLR4） and NF-κB p65 in nasal mucosa. Results Compared with the normal group， the contents of IL-4， IL-5， IgE and proteins and gene expressions of TLR4 and NF-κB p65 in the model group increased significantly， IL-10 and IFN-γ decreased significantly （P<0.01） and proteins and gene expressions of TLR4 and NF-κB p65 in nasal mucosa increased significantly （P<0.01）； Compared with the model group， the contents of IL-4， IL-5 and IgE in Yupingfeng Powder medium- and high-dosage groups decreased significantly IL-10 and IFN-γ decreased significantly （P<0.05， P<0.01）， and proteins and gene expressions of TLR4 and NF-κB p65 in nasal mucosa increased significantly （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Yupingfeng Powder has a certain therapeutic effect on AR by regulating the TLR4/NF-κB signaling pathway and inflammatory cytokines in model rats.

Keywords： allergic rhinitis； Yupingfeng Powder； TLR4/NF-κB signaling pathway； immune factor； rats

变应性鼻炎（allergic rhinitis，AR）又称过敏性鼻炎，是一种吸入变应原而导致的以鼻黏膜嗜酸性颗粒细胞、T淋巴细胞等多种炎性细胞浸润，免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介导免疫细胞释放化学介质诱发的Ⅰ型变态反应炎性疾病，其主要临床特征是鼻痒、喷嚏、鼻分泌亢进和鼻黏膜肿胀等。AR发病与多种因素相关，病因复杂。目前大多数研究表明，AR病理生理变化主要由炎性介质引发，免疫细胞分泌炎症因子参与AR发病的复杂模式，但其发病机制尚未彻底阐明[1-2]。近年来随着人们生活方式和生活环境的改变，AR发病率呈逐年增加的趋势。本研究采用卵清白蛋白致敏建立AR大鼠模型，观察玉屏风散对AR鼻黏膜上皮细胞TLR4/NF-κB信号通路的影响，探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雄性Wistar大鼠50只，体质量250～300 g，上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号SCXK（沪）2012-0002。饲养于室温（25 ℃）、相对湿度45%～55%环境，12 h/12 h明暗交替，常规喂养7 d。

1.2 药物及制备

玉屏风散（黄芪380 g，麸炒白术120 g，防风60 g），饮片均由福州同春中药有限公司提供。将防风提取挥发油后与黄芪、麸炒白术加8倍水合煎，第1次煎煮1.5 h，第2次煎煮1 h，合并2次煎液。70%乙醇进行药渣沉淀，取上清液，减压浓缩加水适量，混匀、静置。取上清液，过滤，经减压浓缩与冷冻干燥后冻干成粉，4 ℃冰箱保存备用。

1.3 主要试剂与仪器

白细胞介素（IL）-4、IL-5、IL-10、IgE和干扰素-γ（IFN-γ）ELISA试剂盒，欣博盛生物科技有限公司；Toll样受体4（TLR4）、核因子-κB（NF-κB）抗体，美国Cell signling公司；RNA提取试剂盒，美国Invitrogen公司；PCR试剂盒，日本Takara公司。Power Wave XS2 酶标仪（美国Bio Tek公司），SLEE冷冻切片机（德国），DX45显微镜（日本奥林巴斯），THZ-312型台式恒温振荡器（上海精宏实验设备有限公司），PCR仪、Smartspec Plus核酸蛋白测定仪、电泳仪、凝胶成像分析系统（美国Bio-RAD公司）。

2 实验方法

2.1 分组、造模和给药

将实验大鼠随机分为正常组、模型组和玉屏风散低（6 g/kg）、中（12 g/kg）、高（24 g/kg）剂量组。参照文献[3]方法制作AR大鼠模型。以0.3 mg卵清白蛋白为抗原，以30 mg Al（OH）3为佐剂，溶于1 mL生理盐水制成混悬液，腹腔注射进行基础致敏，隔日1次，连续8次，共15 d。第16日开始，采用微量加样器经鼻滴入50 μL卵清白蛋白（10 mg/100 μL），连续7 d，强化致敏。最后1次滴鼻给药后立即观察大鼠30 min内打喷嚏和挠鼻的次数，按AR行为学指标进行评分，总分≥5分表示造模成功[4]。玉屏风散各剂量组给予相应浓度药液灌胃，正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃。给药体积均为1 mL/100 g，每日1次，连续10 d。

2.2 大鼠行为学评分标准

鼻痒程度：轻擦外鼻几次，计1分；抓挠鼻面不止，到处摩擦计2分；喷嚏次数：1～3个计1分，4～10个计2分，11個以上计3分；流涕：流至前鼻孔计1分，超过前鼻孔计2分，流涕满面计3分。总分>5分为造模成功[5]。

2.3 大鼠鼻黏膜形态观察

末次给药后，10%水合氯醛腹腔注射大鼠麻醉，从鼻背部正中缝处裂开鼻腔，快速取出鼻黏膜，10%中性缓冲液福尔马林对脑组织进行固定，常规冰冻切片，采用乙醇逐级脱水，二甲苯透明处理，石蜡包埋，切片（厚约3 μm），HE染色，镜下观察。

2.4 大鼠血清炎症因子含量测定

末次给药后，10%水合氯醛腹腔注射大鼠麻醉，腹主动脉采血，室温放置1 h，4 ℃、3000 r/min离心15 min，取上清液，置于1.5 mL EP管。ELISA测定血清IL-4、IL-5、IL-10、IgE和IFN-γ含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。

2.5 Western blot检测大鼻黏膜核因子-κB p65和Toll样受体4蛋白表达

称取适量大鼠鼻黏膜，液氮研磨，按10∶1比例加入组织蛋白裂解液，再加入广谱的磷酸酶抑制剂（1∶100）和PMSF（1∶100），冰浴放置2 h，振荡，4 ℃、15 000 r/min离心20 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度。计算出相应的上样量并加入相应的缓冲盐，然后加热变性10 min，行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后将蛋白转移至PVDF膜上，5%胎牛血清封闭2 h，加入一抗，4 ℃过夜，TBST洗5 min×3次，加入荧光二抗进行曝光，采用Image Studio软件分析目的蛋白相对表达量。

2.6 RT-PCR检测大鼠鼻黏膜核因子-κB p65和Toll样受体4基因表达

称取适量大鼠鼻黏膜，液氮研磨匀浆，采用Trizol法提取鼻黏膜总RNA。将提取总RNA（8 μL）加反转录反应体系混合（共20 μL），合成cDNA。然后按说明书操作进行qPCR，检测鼻黏膜NF-κB p65、TLR4 mRNA的表达，Tanon-2500凝胶图像分析系统分析凝胶结果，BI-2000图像分析系统计算相应蛋白mRNA与β-actin mRNA积分吸光度比值，作为其相对表达量。

3 统计学方法

采用Graph Pad Prism 5.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 大鼠行为学评分结果

正常组大鼠活动、饮食等均正常，无打喷嚏、流鼻涕、抓挠鼻等AR特征。模型组大鼠在局部致敏当日均出现不同程度挠鼻、流鼻涕等现象，造模10 min后最明显，40 min后所有症状基本消失。随造模时间延长，模型组症状逐渐加重，出现典型AR特征，第5日后正常组与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01），表明造模成功。玉屏风散各剂量组AR特征均明显改善。结果见表1。

4.2 大鼠鼻黏膜形态观察结果

正常组大鼠鼻黏膜上皮组织结构完整，淋巴细胞浸润不明显，未见明显组织及腺体增生；模型组大鼠鼻黏膜上皮组织有明显的脱落现象，黏膜固有层见大量嗜酸性颗粒细胞及肥大细胞浸润，可见不同程度组织水肿，小动脉血管扩张及血浆渗出，并伴有腺体增生；玉屏风散各剂量组大鼠鼻黏膜病理特征均有改善，上皮组织部分脱落，并有少量炎性细胞浸润，其整体状况明显优于模型组。结果见图1。

4.3 玉屏风散对模型大鼠血清炎症因子含量的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清IL-4、IL-5和IgE含量显著升高，IL-10和IFN-γ含量显著降低（P<0.01）；与模型组比较，玉屏风散中、高剂量组IL-4、IL-5和IgE水平显著降低，IL-10和IFN-γ水平显著升高（P<0.05，P<0.01）。结果见图2。

4.4 玉屏风散对模型大鼠鼻黏膜Toll样受体4和核因子-κB p65蛋白和基因表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠鼻黏膜TLR4和NF-κB p65蛋白和基因表达均显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，玉屏风散中、高剂量组大鼠鼻黏膜TLR4和NF-κB p65蛋白和基因表达均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见图3～图6。

5 讨论

AR属中医学“鼻鼽”范畴，历代医学家将其病因病机归属于肺、脾、肾三脏虚损，外由风寒异气之邪侵袭。临床研究也表明AR为本虚标实，虚实夹杂[6]。本虚多责之于肺、脾、肾虚，肺气虚弱多贯穿于鼻鼽的始终。玉屏风散方中防风遍行周身，上清头面七窍，内除骨节痛痹，外解四肢挛急，为风药中之润剂，治风独取此味，任重功专。然卫气者，所以温分肉而充皮肤，肥腠理而司开合。惟黄芪能补三焦而实卫，为玄府御风之关键，且有汗能止，无汗能发，功同桂枝，故又能除头目风热，大风癞疾，肠风下血，妇人子脏风，是补剂中之风药也。所以防风得黄芪，其功愈大耳。白术健脾胃，温分肉，培土即以宁风。夫以防风之善驱风得黄芪以固表，则外有所卫；得白术以固里，则内有所據，风邪去而不复来。

本研究通过卵清白蛋白激发Wistar大鼠建立AR模型，通过行为学评分和鼻黏膜HE染色对模型进行评价。结果显示模型组大鼠出现明显AR特征，表明造模成功；当连续予玉屏风散15 d后，玉屏风散中、高剂量组模型大鼠临床特征有所改善。为进一步评价模型成功与否，本实验对其鼻黏膜进行HE染色，病理显示模型组大鼠鼻黏膜上皮组织有明显脱落现象，黏膜固有层见大量的嗜酸性颗粒细胞及肥大细胞浸润，可见不同程度的组织水肿，小动脉血管扩张及血浆渗出，并伴有腺体增生。当给予玉屏风散后，各给药组大鼠鼻黏膜病理特征均有改善，亦有部分脱落，并有少量的炎性细胞，其整体状况明显优于模型组，其中高剂量组改善效果最明显，已趋近正常组水平。

机体免疫中Toll样受体（TLR）是哺乳动物细胞中唯一将细胞外抗原识别信息向细胞内传递的跨膜蛋白，在病原体识别中发挥着重要作用[7]。TLR表达于哺乳动物的免疫细胞表面，能特异性识别病原微生物进化中特定的病原体。呼吸道鼻黏膜上的树突状细胞、巨噬细胞、黏膜上皮细胞和内皮细胞上分布有不同的TLR亚型，不同亚型能针对特定微生物感染源产生免疫应答。当特应性个体接触致敏原后，导致Thl/Th2细胞因子网络失衡，Th2型细胞因子表达量在其疾病发生过程中均异常增高，对于该病的发生起着重要作用。有研究表明，当给予哮喘模型小鼠一定剂量脂多糖刺激后，小鼠体内Th2水平显著增加；但在TLR4基因敲除小鼠中，却未能发现Th2水平的升高。此外，有研究显示，活化的TLR4能激活下游的NF-κB信号通路。NF-κB信号通路是介导细胞内信号传递的重要核转录因子，其通过调节免疫和炎性相关因子及炎性介质之间的级联放大瀑布效应，在炎性和免疫反应中起枢纽作用，在许多信号通路传导中起核心作用，参与多种基因的表达和调控[8-9]。

近年研究认为，TLR4/NF-κB信号通路在AR发病过程中扮演重要角色。TLR4通过与外源性配体结合后活化TLR4-MyD88依赖性途径，进一步激活NF-κB信号通路。活化的NF-κB亚基p65能直接作用于转录元件进而激活转录过程，从而启动一系列免疫相关基因，如前炎性介质、黏附分子、趋化因子等转录程序，使其表达量增加，促进大量炎性细胞浸润，诱发或加重炎症发生[8]。此外，活化的NF-κB p65通过启动核内相关基因的表达，导致Th1/Th2平衡失调，Th2细胞比例增多；Th2淋巴细胞释放的细胞因子主要是IL-4、IL-5，介导机体体液免疫。当机体Th1细胞分泌的IFN-γ不足时导致Th2功能亢进，诱发IL-4、IL-5过多产生。其中IL-4能促进机体产生IgE，诱发AR。IL-5为机体维持和延续速发性变态反应形成炎症主要炎性介质，进而诱发AR的典型病理改变。IL-10是由Tr1细胞分泌的抗炎因子，可抑制炎性细胞合成，用来探究和评价药物的治疗效果。

本研究通过测定大鼠血清IL-4、IL-5、IL-10、IgE和IFN-γ水平变化，发现模型组大鼠血清IL-4、IL-5和IgE含量均显著升高，IL-10和IFN-γ含量显著降低；当给予玉屏风散干预后，各给药组大鼠血清炎症因子水平均有所回调，其中，玉屏风散中、高剂量组IL-4、IL-和IgE含量显著降低，IL-10和IFN-γ含量显著升高，表明玉屏风散对AR引发的炎症因子水平异常有明显改善作用。为进一步探究玉屏风散对TLR4和NF-κB信号通路的改善作用，对各组大鼠鼻黏膜TLR4和NF-κB p65蛋白和基因表达进行测定，结果表明玉屏风散能显著调节TLR4和NF-κB p65蛋白和基因表达，对TLR4/NF-κB信号通路有显著调节作用，且呈剂量依赖性。

综上所述，TLR4/NF-κB信号转导通路在AR的发病过程中扮演了重要的角色；玉屏风散可能通过调节模型大鼠TLR4/NF-κB信号通路及相关炎性因子，起到治疗AR的作用。

参考文献：

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