头针电刺激对急性脑梗死大鼠血小板活化标志物CD62P、CD63的影响

张铭铭 杨 杰

（1.武汉大学人民医院，湖北 武汉 430060；2.湖北省第三人民医院，湖北 武汉 430060）

急性脑梗死（ACI）是一个复杂的缺血性级联反应过程，严重缺血造成脑组织能量很快耗竭，从而发生的一系列病理生理变化［1］。有文献报道ACI引发的多种复杂的病理变化包括炎症反应、细胞凋亡、氧化应激反应及兴奋性氨基酸毒性作用等，具体发病机制尚未完全阐明［2］。ACI是继恶性肿瘤、心肌梗死后又一严重影响人类健康的疾病，从1985年至1991年统计的发病率为 116～219/100 000，死亡率为 118～143/100 000，其中缺血性脑梗死占发病率的75%。缺血性脑梗死又分腔隙性脑梗死（40.6%）、动脉血栓性脑梗死（21.5%）、栓塞性脑梗死（7.5%）及其他原因引起的脑梗死或者TIA［3］。以中老年人发病率较高，幸存者中 30%～50%遗留有不同程度的后遗症［4］。目前，ACI的发病率在中国呈上升趋势，给家庭和社会带来了沉重的负担。本研究以CD62P、CD63为切入点，通过头针电刺激干预大鼠右侧大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血模型，观察血清中CD62P、CD63表达的变化及神经功能缺损情况，探究头针电刺激对脑梗死可能的作用机制，为头针电刺激早期治疗提供重要的理论依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠160只，SPF级，体质量 240～280 g，动物许可证号：SCXK（鄂）2008-0005，由湖北省实验动物研究中心提供（本实验遵循国际上广泛接受的减少、替代、优化为主的3R试验动物伦理学原则）。所有大鼠在实验室常规饲养1周，自由进食、饮水，通风、自然光照，10～12只分笼饲养。

1.2 试药与仪器 大鼠CD62P、CD63酶联免疫吸附试剂盒，购自武汉博士德生物制品有限公司；10%水合氯醛（鄂药制字H20111145），实验室提供；光学显微镜；医用水浴箱、酶标仪、低温电冰箱 （型号MDFU74V，山东博科生物产业有限公司）；一端经过石蜡制备后的渔线（长度15 mm）；华佗牌一次性无菌针灸针，规格0.20 mm×25 mm，苏州医疗用品厂有限公司生产；KDZ-Ⅱ型电针仪（扬州市凯达医疗设备）。

1.3 模型制备 参照Zea Longa改良线栓法［5］制备右侧大脑中动脉阻塞（MCAO）动物模型。术前准备及步骤：术前禁食不禁水24 h，随后称质量。用10%水合氯醛腹腔麻醉（0.35 mg/100 g），大鼠完全麻醉后将其固定于操作台之上，颈部皮肤常规消毒备皮，沿右颈部正中线切开1.5 cm切口，剪开阔筋膜，显露右侧胸锁乳突肌，从胸锁乳突肌和胸骨舌骨肌间向深部分离即达到颈总动脉鞘，用血管钳将颈总动脉鞘及皮下组织向两侧牵开，用玻璃分针小心分离出右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）及颈内动脉（ICA）；用手术缝合线结扎右ECA及CCA近心端，不剪断ECA，不结扎翼腭动脉，以动脉夹夹闭ICA；用6号注射器针头于右CCA结扎的远心端（距CCA分叉处约2～3 mm）刺入，导入栓塞线，松开ICA动脉夹，调整好插线的角度及方向，栓线经CCA顺利地进入ICA，直至右侧大脑中动脉（MCA）的起始部，稍遇到阻力即停止，长度约20～22 mm，说明线栓头部进入MCA，阻断血流，用缝合线系住栓塞线；确认无出血后逐层缝合，伤口局部消毒。假手术组除不结扎插线其余步骤同上。大鼠苏醒后，有以下表现即表示造模成功：提尾时左侧前肢内收屈曲；右眼Horner征；爬行时向左侧划圈；左侧肢体的疼痛回缩或消失，就可列入实验研究［6］。

1.4 干预方法 所有大鼠采用随机数字表法分为头针电刺激组、普通针刺组、假手术组和模型对照组，4组又分1 d、3 d、7 d和14 d组4个亚组，每组10只大鼠，并用苦味酸标记编号。头针电刺激组及普通针刺组参照华兴邦制定的《动物针灸穴位图谱》［7］，选取大鼠的百会穴及大椎穴，大鼠造模成功24 h后，将其俯卧并固定于操作台，实施头针电刺激及普通针刺治疗。具体操作方法：首先常规皮肤消毒，用0.20 mm×25 mm毫针，取百会向前平刺0.5寸，大椎穴直刺0.5寸，两穴接入KDZ-Ⅱ型电针仪的正负两极，选择疏密波，留针30 min，刺激时长选为每日1次，每次30 min，普通针刺组除不接电针，其余操作同头针电刺激组，依据术后时间确定治疗疗程分别为1、3、7、14 d。其余两组大鼠每天在相同时间固定于操作台30 min，不进行任何干预，疗程与头针电刺激组相同。各组大鼠干预期间给予正常饮食，观察毛发光泽、活动及大小便等，每周称重，记录体质量变化。疗程结束后，大鼠禁食过夜，脱臼处死，取大鼠股动脉血，离心，分离血清待测。

1.5 观察项目 1）采用Bederson神经功能缺损评分［8］在1、3、7和14 d干预前后进行评分，并记录实验数据。0分为无神经功能缺损；1分为不能完全伸展左侧前肢，左腕、肘、肩关节屈曲；2分为左肩部侧推抵抗力下降；3分为活动时向左转圈；4分为不能自发行走，意识障碍。2）取大鼠股动脉血，用抗凝管进行收集，然后用离心机以2000 r/min的速度离心30 min，用移液枪吸取中间黄衣层置于EP管内，然后放入-20℃冰箱中备用。采用双抗体酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清中CD62P、CD63的含量，具体操作严格按照说明书进行操作。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组内治疗前后比较采用配对t检验，组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清CD62P、CD63表达比较 见表1。头针电刺激组、普通针刺组和模型对照组与假手术组比较，大鼠血清中CD62P、CD63表达均增加，差异具有统计学意义（P＜0.01）；头针电刺激组、普通针刺组较模型对照组均能降低CD62P、CD63的表达，差异有统计学意义（P＜0.01），且以头针电刺激组降低CD62P、CD63显著（P＜0.01），头针电刺激组中各治疗时间点比较，血清中CD62P、CD63表达明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.01）。普通针刺组中各时间点比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）；模型对照组与假手术组各时间点比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。以上结果说明头针电刺激能充分抑制脑梗死大鼠CD62P、CD63的表达，其中以14 d组效果最佳。

表1 各组大鼠血清 CD62P、CD63表达比较（ng/mL，±s）

表1 各组大鼠血清 CD62P、CD63表达比较（ng/mL，±s）

与本组治疗14 d比较，*P＜0.01；与假手术组同时期比较，△P＜0.01；与模型对照组同时期比较，▲P＜0.01；与普通针刺组同时期比较，#P＜0.01。 下同

组别 时间 C D 6 2 P C D 6 3头针电刺激组 治疗 1 d 1 8.6 7±2.8 4*△▲# 5 6.6 4±4.3 7*△▲#（n＝1 0） 治疗 3 d 1 7.7 2±2.6 6*▲# 5 4.7 1±4.1 8*▲#治疗 7 d 1 5.4 6±2.2 8*▲# 5 0.4 7±4.2 5*▲#治疗 1 4 d 1 2.8 5±1.7 3*▲# 4 3.8 6±3.8 3*▲#普通针刺组 治疗 1 d 1 8.8 9±2.8 6△▲ 5 7.2 3±4.4 5△▲（n＝1 0） 治疗 3 d 1 8.1 3±2.8 0▲ 5 6.3 5±4.2 6▲治疗 7 d 1 7.2 5±2.5 8▲ 5 3.5 8±4.0 2▲治疗 1 4 d 1 4.6 4±2.1 7▲ 5 0.7 4±3.9 0▲模型对照组 治疗1 d 1 8.9 2±2.8 4△ 5 6.8 8±4.4 1△（n＝1 0） 治疗 3 d 1 8.8 1±2.7 5 5 6.2 2±4.3 8治疗 7 d 1 8.0 2±2.5 4 5 5.6 3±5.2 5治疗 1 4 d 1 7.3 6±2.3 3 5 3.4 7±4.9 6假手术组 治疗 1 d 1 1.3 1±2.0 7 3 4.2 7±2.6 5（n＝1 0） 治疗 3 d 1 1.0 7±1.9 6 3 3.8 4±3.1 7治疗 7 d 1 0.8 5±1.7 8 3 3.0 6±2.8 3治疗 1 4 d 9.7 9±1.6 5 3 2.5 6±2.9 1

2.2 各组大鼠不同时间点Bederson评分比较 见表2。头针电刺激组、普通针刺组Bederson评分随治疗时间延长而逐渐降低，模型对照组14 d时略有下降。头针电刺激组与普通针刺组及模型对照组比较，3 d、7 d及14 d组差异具有统计学意义（P＜0.05），表明头针电刺激能显著改善脑梗死大鼠神经功能缺损情况；头针电刺激组中各治疗时间点评分比较，随着时间增加，评分降低（P＜0.05）；普通针刺组中各治疗时间点评分比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型对照组与假手术组各治疗时间点比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。表明头针电刺激时间越长，脑梗死大鼠神经功能改善越明显，且以14 d为最佳。

表2 各组大鼠不同时间点Bederson评分比较（分，±s）

表2 各组大鼠不同时间点Bederson评分比较（分，±s）

组 别 n 治疗前 治疗1 d 治疗3 d 治疗7 d 治疗1 4 d头针电刺激组 1 0普通针刺组 1 0模型对照组 1 0 3.4 6±0.4 8* 3.4 5±0.4 6*3.0 5±0.5 1*▲3.3 7±0.5 3 3.3 5±0.5 2 3.1 7±0.4 9▲3.4 0±0.4 7 3.4 3±0.4 7 3.4 0±0.4 6 2.6 3±0.4 2*▲ 1.3 8±0.3 6*▲2.9 4±0.4 6▲ 2.4 6±0.4 3▲3.2 6±0.4 8 3.0 9±0.5 0假手术组 1 0 0 0 0 0 0

3 讨 论

CD62P、CD63是血小板活化的2个特异性标志物［10］，其中CD62P又称P选择素，主要分布在内皮细胞及ɑ颗粒，是血小板表面的一个富含半胱氨酸、高度糖基化的糖蛋白，属于选择素家族黏附分子［11］。在静止血小板表面平均每个血小板仅表达700个CD62P分子，如果被活化，血小板内α颗粒与质膜融合并且释放，使平均每个血小板表达11000个CD62P分子，并且介导血小板、内皮细胞与单核细胞、中性粒细胞间的作用［12］。CD63为血小板溶膜体完整糖膜蛋白，在静止血小板表面仅有少量表达。

ACI的发病是诸多因素共同参与的复杂过程，在梗死中心区的缺血缺氧造成了自由基产生、血小板活性因子的释放、脑水肿等引起脑神经元代谢紊乱，大量钙离子内流，使细胞超载线粒体钙离子沉着，发生不可逆性神经元死亡［13］。在ACI的发生发展过程中，血小板活化使存在于血小板胞质内的CD62P、CD63迅速迁延到血小板的表面，并且大量表达，介导并启动血小板与白细胞、内皮细胞间的黏附，除引起血栓外，还释放血管活性物质损伤微循环，阻碍侧支循环的建立［14］。国内外文献报道血小板活化在ACI的发病机制中发挥了重要作用［15］。 Metzelaar等认为 CD62P、CD63 的表达需要较强的刺激诱导，与其他活化血小板表面标志物相比，不易体外激活，更符合临床指标所需的简便易行等条件，不易因个体操作的不同而引起较大差异，是2 个可靠指标［16］。

目前治疗ACI的主要手段为溶栓、抗凝、护脑以及对症治疗，虽能降低患者的生命风险，但是对促进患者肢体功能恢复无显著作用［17］。头针电刺激治疗作为一种非药物治疗，具有疗效显著、操作简便等优点。古人云“急则用针，缓则用药”“药之不及，针之所为”。《针灸大成》载“卒暴中风，顶门、百会”“初中风跌倒……不省人事，牙关紧闭，药水不下，急以三棱针刺手十二井，当去恶血……乃起死回生妙诀”。近年来，随着对急性脑梗死研究的深入，李晓宁等报道针灸可以改善大脑局部血供及神经功能，推测电针治疗急性脑梗死疗效最好并且存在最佳时间窗［18］。张纯等报道电刺激能将头针的疗效发挥最大作用，早期或者超早期头针电刺激治疗，能促进脑侧支循环的建立，改善脑组织的血流量，加强脑细胞的代偿能力，可使缺血受损的神经突触数目得到恢复，从而改善运动功能，减少或者减轻后遗症的发生［19］。

本实验通过观察头针电刺激对右侧MCAO大鼠血清CD62P和CD63水平、神经功能缺损以及最佳治疗时间窗的影响，结果表明头针电刺激能够降低CD62P、CD63表达，且时间越长，脑梗死大鼠神经功能改善越明显，且以14 d为最佳。此为头针电刺激治疗急性脑梗死在分子层面提供了理论基础。