电针对大脑中动脉阻塞大鼠学习记忆功能及海马CA1区突触素的影响*

杨敏光 黄 佳 宋长明 金 昊 李 珑 柳维林 陶 静 ，2，3 陈立典 ，2，3，4△

（1.福建中医药大学康复医学院，福建 福州 350122；2.福建省康复技术协同创新中心，福建福州 350122；3.康复医疗技术国家地方联合工程研究中心，福建 福州 350122；4.国家中医药管理局中医康复研究中心，福建 福州 350122）

脑卒中患者认知功能障碍的发生，会对患者日常生活造成严重影响。认知功能障碍对患者的康复效率产生了严重影响，并会阻碍其全面康复，对患者、家属以及社会来说都是极大的负担和影响［1］。学习记忆的基础是突触的可塑性，突触结构和功能的可塑性变化是神经康复的基础，突触蛋白在突触前膜有大量分布，其在突触连接的形成、维持与调节神经递质的释放过程中均可发挥重要的作用。突触素（SYN）可以促进突触的形成，参与神经生长、修复再生和突触重塑，是突触重建的重要标志。其具体的含量与突触数目的数量呈正相关，并且会影响学习记忆能力［2-3］。课题组前期基础和临床研究均已证实［4-5］：针刺对脑卒中后的认知功能障碍疗效明确，但其作用机制还有待探讨。基于此，本研究通过观察电针神庭、百会穴对大脑中动脉阻塞大鼠的海马CA1区突触素的影响及其对认知功能的改善，探究其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 由上海斯莱克实验动物责任有限公司［许可证号：SCXK（沪）2012-003］提供 SPF 级雄性SD大鼠，体质量（250±30）g，在福建中医药大学实验动物中心［许可证号：SYXK（闽）2013-005］分笼并进行适应性喂养1周，随后对大鼠编号并称重。实验过程均严格按照国际动物保护和使用指南的规定操作。

1.2 试剂与仪器 一抗：SYN antibody（ab8049），Abcam 生产；二抗：Alexa Fluor 488（A21202），Life Technologies生产，批号为1562298。线栓（广州佳灵生物技术有限公司，3800AAA）、G6805型电针仪（苏州医疗用品厂有限公司）、7.0 T小动物核磁共振仪（Pharmascan；microMRI，Bruker，Germany）、Barnes 迷宫（上海欣软信息科技有限公司）、荧光倒置显微镜系统DMI4000B（徕卡仪器公司）、Motic Med 6.0数码医学图像分析系统。

1.3 造模与分组 本试验设立假手术组、模型组、电针组3组，由于MCAO大鼠尚无绝对明确的针灸配穴因而未设置阳性对照组。利用随机数字表将25只健康雄性SD大鼠随机分为造模手术组（n=19）和假手术组（n=6），参考 Koizumi方法［6］，对造模手术组行左侧大脑中动脉栓塞造模（MCAO）。麻醉选用腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g），沿颈正中线切开皮肤，随后分离左侧颈总，颈外和颈内动脉。用不可吸收线结扎颈总及颈外动脉，并用血管夹夹闭颈内动脉。于左侧颈总动脉的结扎点上方近侧端用维纳斯剪剪开一“V”形小口，将线栓由此口向颈内动脉方向轻缓推入，行进到夹闭处时松开血管夹，随后把插入颈内动脉的线栓继续轻推至颅内，待感到轻微阻力时不再推入，造成局灶性脑缺血并缝合皮肤，清洁创口。推入线栓90 min后抽出部分线栓并剪断暴露在创口外的部分，形成再灌注。假手术组仅对大鼠的左侧颈总、颈内、颈外动脉进行分离，并不结扎，随后缝合皮肤，清洁创口。术中注意保暖，待大鼠苏醒并恢复活动后进行神经行为学评分。采用Zea Longa 5分评价法在手术完成2 h后判断手术是否成功。利用随机数字表法将评分在1～3分的12只大鼠随机分为模型组和电针组，每组各6只，0分及4分的7只则剔除，假手术组也为6只。

1.4 干预方法 在手术完成后第2日（该日为干预第1日），电针组取穴百会、神庭。百会：顶骨正中。神庭：在额顶的前正中线上的骨缝交界线前方。两穴均采用45°角斜刺2 mm。电针仪参数设置如下：疏密波，频率1/20 Hz，电流强度 1～3 mA，每次电针 30 min，选择每日上午的相同时间进行电针，同时对假手术组和模型组行同等条件抓取30 min后回笼饲养，不予任何其他干预，至干预7 d后将3组实验动物处死。

1.5 观察项目 1）Barnes巴恩斯迷宫测试：Barnes迷宫实验可以检测实验动物的空间学习记忆能力［7］。检测前将大鼠会被置于目标盒内30 s，测试时采用恒定的光刺激和声刺激等干扰因素作为大鼠进入目标盒的动机。电针第3日开始检测，实验时把大鼠放置在圆形平台中央的起始盒内（黑色，不透明），撤走起始盒的同时开启声刺激和光刺激并开始300 s倒计时，摄像头记录其进入目标盒所用的时间（既逃避潜伏期）和探索错误洞口的次数，连续5 d。若大鼠在时间结束前未能进入目标盒，将逃避潜伏期算作300 s。每次测试结束后顺时针旋转上层圆形平台18°并用消毒酒精纱布进行擦拭清洗平台和目标盒，每次仅旋转上层平台但保持目标盒的相对空间位置不改变。2）Zea Longa评分：手术完成后2 h及干预的第1、3、7日进行Zea Longa神经功能缺损评分，该评分由不知情的观察者来完成。3）小动物磁共振仪扫描：小动物核磁共振成像分析系统 （MiniMR-60 MRI system 7.0 T）对实验大鼠进行T2WI扫描，观察大鼠左侧大脑梗死体积。T2WI扫描参数 ：TR 2738 ms，TE 33 ms，TR/TE ＝4111.669/55 ms，FoV＝32×32mm，Averages＝2，Matrix＝256×256，Slices＝21，Slice Thickness=0.8 mm，Time=5 min 50 s， 每次扫描21层。T2WI扫描出的原始数据用Image J软件进行脑梗死区域的计算。

1.6 免疫荧光染色 3组大鼠均于造模后第8日取材。选用腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉。先腹主动脉放血，夹闭腹主动脉切口近心端，迅速剪断肋骨，打开胸腔，暴露心脏。在右心耳处剪一小口，随后将灌胃针从左心尖部插入至主动脉弓，用注射器先后灌注0.9%氯化钠溶液200 mL、4%多聚甲醛200 mL，迅速取出完整大脑，浸泡固定于4%多聚甲醛溶液。石蜡包埋切片。玻片微波修复后滴加5%驴血清和5%牛血清混合液封闭，37℃孵育2 h。滴加SYN一抗（ab8049，ABCAM，1∶50） 后置于 4 ℃冰箱内孵育过夜，次日复温后用0.01 mol/L PBS冲洗3次，每次5 min。于避光条件下滴加荧光二抗，在37℃烘箱内避光孵育2 h，0.01 mol/L PBS清洗3次，每次5 min。 用PBS稀释 DAPI（1∶1000），孵育 1 min，PBS 清洗 5 min。抗荧光淬灭处理及封片，封片剂风干后，立即用荧光倒置显微镜 （徕卡仪器公司）100倍下观察，Motic Med 6.0数码医学图像分析系统对免疫荧光染色切片进行图像分析，阳性细胞的免疫反应强度用平均光密度（OD值）表示。

1.7 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料以（±s）表示。各个组间的比较均采用单因素方差分析，方差齐者用LSD法，方差不齐则用Games Howell法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分比较 见表1。缺血再灌注后2 h和干预第1、3、7日对各组大鼠进行Zea Longa神经行为学评分，如表1所示：假手术组神经功能正常；电针干预前模型组和电针组大鼠均存在不同程度的神经功能缺损症状，组间比较无明显差异（P＞0.05）；与假手术组相比，模型组和电针组均有明显的差异（P＜0.01，P＜0.05）。干预后第 3、7 日，模型组和电针组大鼠Zea Longa评分逐渐下降，神经功能障碍有不同程度的恢复，干预后第7日，电针组与模型组相比有显著差异 （P＜0.05），表明电针百会、神庭穴对MCAO大鼠的神经功能缺损症状改善明确。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠神经功能缺损评分比较（分，±s）

与假手术组比较，*P＜0.01，**P＜0.001；与模型组比较，△P＜0.05

?组 别 n 干预前 第1日 第3日 第7日假手术组 6模型组 6 0 0 0 0 2.6 7±0.2 1*2.5 0±0.2 2*2.0 0±0.2 4**1.8 3±0.1 7*电针组 6 2.3 3±0.3 3 2.1 7±0.3 3 1.1 7±0.3 1△ 0.5 0±0.2 2△

2.2 各组大鼠脑梗死体积比较 见图1，表2。各组大鼠在干预前（即造模后第24小时）及干预7 d后进行小动物磁共振T2WI检测脑梗死体积。如图1所示，其中缺血梗死部位为高信号白色区域。结果如表2所示：假手术组无高信号区域；干预前模型组和电针组未存在显著差异（P＞0.05），而与模型组相比，电针百会、神庭7 d后脑梗死体积明显降低（P＜0.01），表明电针百会、神庭穴对MCAO大鼠的脑部病变有明确疗效。

图1 各组大鼠磁共振T2加权成像

表2 各组大鼠脑梗死体积百分比比较（%，±s）

表2 各组大鼠脑梗死体积百分比比较（%，±s）

与假手术组比较，△P＜0.001；与模型组比较，▲P＜0.01，▲▲P＜0.001

组 别 n 干预前 第7日假手术组 6模型组 6 0 0 2 9.1 6 1±0.0 0 5△ 2 7.8 3±0.0 1 5△电针组 6 2 8.8 2 8±0.0 1 2 1 9.7 4 3±0.0 0 5▲

2.3 各组大鼠空间学习记忆能力比较 见图2，表3、表4。Barnes迷宫实验结果如表3、表4所示：模型组和电针组逃避潜伏期相较于假手术组均显著增加；且与假手术组相比，模型组逃避潜伏期一直明显延长，差异具有统计学意义（P＜0.001）。 在第 3、4、5、6 日各时间点，电针组的逃避潜伏期与模型组均明显缩短，差异具有统计学意义（P＜0.01）。在电针干预的第7日，电针组逃避潜伏期明显较模型组缩短，其差异具有显著统计学意义（P＜0.001）。与此同时，电针组和模型组探索错误洞口次数较假手术组均显著增加；但与模型组相比，电针组MCAO大鼠探索错误洞口的次数显著减少，差异具有统计学意义（3 d：P＜0.05；4 d：P＜0.01；5 d：P＜0.05；6 d：P＜0.01；7 d：P＜0.001）。 从图 2 中看出，电针干预第7日，假手术组探索路程最短，能快速找到目标盒，电针组探索路程稍长，耗时稍多。而模型组大鼠的探索轨迹遍布整个平台，没有明确的方向，进入目标盒的探索路程和时间均为最长。以上实验结果表明电针百会、神庭穴对MCAO大鼠损伤的空间学习记忆能力有明显改善。

图2 干预第7日各组大鼠寻找目标洞口轨迹图

表3 两组大鼠逃避潜伏期比较（s，±s）

表3 两组大鼠逃避潜伏期比较（s，±s）

与假手术组比较，△P＜0.001；与模型组比较，▲P＜0.01，▲▲P＜0.001

组 别 n 第3日 第4日 第5日第6日 第7日假手术组 6模型组 6 1 1 8.5 8±1 3.1 9 1 0 9.7 4±1 5.1 3 9 3.2 1±1 1.5 1 2 3 2.3 4±1 4.4 1△ 2 2 8.6 9±1 6.9 2△ 2 2 3.4 5±2 3.5 4△7 8.9 7±9.8 8 7 2.9 2±7.5 3 2 1 7.4 5±2 2.2 0△ 1 9 7.6 5±2 0.5 0△电针组 6 1 7 8.0 8±1 9.8 2▲ 1 7 1.9 6±9.0 6▲ 1 3 3.8 9±1 8.1 6▲1 2 9.4 8±1 6.5 8▲ 1 0 7.6 6±1 1.2 9▲▲

表4 两组大鼠进入错误洞口次数比较（次，±s）

表4 两组大鼠进入错误洞口次数比较（次，±s）

与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001

?组 别 n 第3日 第4日 第5日第6日 第7日假手术组 6模型组 6 1 4.7 2±1.7 5 1 1.5 6±0.8 7 1 3.1 7±1.2 5 2 4.1 1±1.8 0**2 0.8 3±1.5 3***2 1.6 7±2.8 1*1 1.0 0±0.8 2 8.5 0±0.7 6 1 8.3 3±1.8 9** 1 5.5 0±1.4 8**电针组 6 1 7.2 1±1.7 1△ 1 4.2 8±1.7 2△△ 1 3.5 0±1.6 9△1 2.5 0±1.2 3△△ 6.3 3±1.2 8△△△

2.4 各组大鼠海马CA1区突触素SYN表达的影响见图3。免疫荧光结果显示，假手术组海马CA1区SYN表达最好，镜下可见大量荧光着色细胞且分布密集；模型组大鼠SYN的表达（0.163±0.033）较假手术组（0.340±0.045）表达明显减少（P＜0.05）；电针组 SYN 表达（0.300±0.103）较模型组显著增加（P＜0.05）。 镜下观察到散在荧光作着色细胞，分布较密集。证明电针促进了MCAO大鼠海马CA1区SYN的表达，进而可能增强其突触可塑性。

图3 各组海马CA1区SYN表达（免疫荧光染色，100倍）

3 讨 论

脑卒中是当前人类最主要的致残因素和第二大死因，脑卒中后患者普遍会出现认知功能障碍。据国外研究报道，卒中后患者有大约2/3会出现认知障碍，而在中国，卒中后发生认知障碍的患者约占55.9%［8］。头为诸阳之会、神明之府，调控人的认知与情感，且手足阳经皆汇集于头部，而督脉总督一身之阳脉，是人体“阳脉之海”。因此选择督脉的穴位治疗认知功能障碍具有扎实的理论基础。百会穴，主醒脑开窍，是督脉要穴，其穴居巅顶，联系脑部，古人称之为“三阳五会”。其对于调节人体的阴阳平衡，使经气通达周身的大小经穴起着重要的作用。神庭穴为上行之气之聚集，《针灸甲乙经》记载其有宁神、开窍之功。因此本研究选用神庭、百会穴配伍。

针刺对脑缺血模型大鼠的神经功能缺损疗效显著。黄卫玲等［9］研究表明电针百会、四神聪等穴的综合疗效优于对照组，治疗后，神经功能缺损程度评分亦优于对照组。谭峰等［10］研究发现针刺百会、大椎穴可显著改善大鼠脑梗死后神经功能，且效果优于同时间点脑梗死组。潘江等［11］研究发现针刺督脉经穴能减小脑梗死体积和脑梗死率，具有抗神经损伤及神经修复的作用。张蕴等［12］研究表明，电针能明显减少MCAO大鼠脑梗死体积，保护脑部神经元，改善学习记忆功能障碍。本实验证明电针神庭、百会穴可以显著降低MCAO大鼠脑梗死的体积并对其神经功能损伤有明显疗效。

针刺对痴呆模型大鼠的认知功能障碍疗效显著。何甜等［13］通过对血管痴呆模型大鼠针刺后进行水迷宫测试研究发现与模型组相比，针刺组在训练时游泳距离明显缩短，测试时穿越平台次数较模型组增加明显，这表明电针可以明显改善VD大鼠的空间学习记忆的获得和储存能力。张全爱等［14］通过对SAMP8模型小鼠研究发现在水迷宫测试中，针刺组在有效区停留时间显著延长，穿越次数显著升高，提示针刺能有效改善该模型小鼠的学习记忆能力。本研究采用Barnes迷宫检测实验动物的学习记忆能力，研究发现电针组大鼠进入目标洞口的时间显著缩短、进入错误洞口的次数明显减少，提示电针对MCAO大鼠的认知功能障碍起到改善作用。

SYN是位于突触前膜的特异性标志蛋白，突触的数量及生成密度可以由SYN的数量和分布密度间接反映，同时SYN与神经可塑性密切相关［15］。卿鹏等［16］通过针刺局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠百会、曲池、后三里穴发现，海马CA3区SYN的表达显著增加，表明针刺能有效促进大鼠神经功能的恢复及中枢神经系统功能重塑。韩永升等［17］研究表明电针组SYN表达在各时间点较模型组显著增加，差异均有显著性，提示针刺可促进局灶性脑梗死大鼠脑缺血区周围皮质突触素的表达，增强神经可塑性。林晓敏等［18］通过免疫组化发现电针MCAO模型鼠的百会、神庭穴会导致其海马区的SYN表达明显增高（P＜0.01），证明电针百会、神庭穴可以起到调控SYN表达的效果。本研究发现模型组大鼠海马CA1区SYN的表达较假手术组明显减少；电针组SYN表达较模型组显著增加，镜下观察到散在荧光着色细胞且分布较密集，表明电针能够促进MCAO大鼠海马CA1区SYN的表达，增强突触可塑性，从而改善学习记忆功能。

综上所述，电针神庭、百会穴对MCAO大鼠的认知功能障碍疗效显著，其可能的作用机制与促进海马CA1区突触素SYN的表达，进而改善突触可塑性有关。但电针通过何种通路调控SYN的表达仍需进一步深入研究。