菊花离体快繁技术流程概述

苏云凤 岳中辉

(1 哈尔滨师范大学教师教育学院 150025； 2 哈尔滨师范大学生命科学与技术学院 150025)

菊花是菊科菊属的多年生宿根草本植物，是世界四大切花之一，已成为全世界普遍栽培的重要花卉。菊花除了具有很高的观赏价值外，还具有清热解毒、平肝明目等药用价值。菊花主要靠扦插或嫁接繁殖，需较多的母株材料，且受季节和外界环境的限制，繁殖速度较慢。而离体快繁是指利用离体培养技术，将植物的器官、组织或是细胞在合适的条件下用培养基进行培养，在短期内获得大量遗传性一致的个体的方法。对菊花进行离体快繁，可以提高菊花的繁殖系数和繁殖速度，满足菊花种苗的市场需求。本文综述菊花离体快繁的技术流程，为菊花及其他园艺植物的离体快繁研究提供基础资料。

1 菊花离体快繁技术的流程

1.1 外植体的选择 在进行菊花离体快繁时，首先要进行外植体的选择，目前人们采用的外植体有茎尖、茎段、叶片、花瓣、花蕾、花序轴以及花托等。其中最常采用的是幼嫩的带芽茎段，其次是幼嫩的茎尖和花瓣。这些外植体可以来自自然生长的健壮植株，也可以源自离体条件下由种子培养出的无菌苗。外植体选择好后，需要对外植体进行适当的修剪。

1.2 外植体的灭菌 将修剪后的外植体在超净工作台上进行灭菌，常用的灭菌剂是酒精+升汞，即先用70%～75%酒精处理30s，再用0.1%的升汞处理5～20min。当外植体是茎尖、茎段、叶片、花蕾时灭菌时间为5～8min，外植体是花瓣、花序轴、花托时灭菌时间为10～20min。也有学者用酒精+次氯酸钠来灭菌，即先用75%酒精对未开放花蕾进行表面灭菌15s，再用次氯酸钠处理5min(外植体是花瓣)。此外，可用次氯酸钠和戊二醛作为灭菌剂，对花蕾进行灭菌。

1.3 外植体的接种 若外植体是茎尖或茎段，可将其剪成1～2cm大小，基部切成斜切面，插于培养基上完成接种；当外植体是叶片、花瓣时，可将其切成0.5cm×0.5cm大小的小片，按照形态学方向平铺接种；若外植体是花蕾，需要将其纵切成大小相等的3～6块，平放着接种于培养基中；若外植体是花序轴或花托时，则需要把其切成4等块，并将表面向上进行接种。

1.4 外植体的诱导培养 菊花外植体接种后开始进行人工诱导培养，培养温度控制在24～26℃，湿度控制在65%～85%，光照时间10～12h/d，光照强度为1000lx～3000lx。培养时多以MS为基本培养基，加入细胞分裂素(6-BA、KT)和生长素(NAA、IBA、2,4-D、IBA)两类植物生长调节剂，细胞分裂素的浓度一般为1.0～2.0mg/L，生长素的浓度一般为0.1mg/L。若外植体为茎尖或茎段时，可诱导外植体直接成芽，加入的植物生长调节剂一般是6-BA和NAA；若外植体为叶和花时，需要先诱导形成愈伤组织然后成芽，加入的植物生长调节剂是6-BA或KT和NAA或IBA或2,4-D等。

1.5 芽的增殖培养 在外植体诱导成芽后，需要进行继代培养进行芽的增殖。一般也是以MS培养基，加入6-BA和NAA， 6-BA的浓度一般为1.0～2.0mg/L， NAA的浓度一般为0.1mg/L。

1.6 试管苗的生根培养 增殖后的试管苗长到2cm高以上时，即可转接至生根培养基上进行生根培养。大多数研究是用1/2 MS作为基本培养基，再向培养基中加入NAA， NAA的浓度一般为0.1～0.2mg/L，也有学者加入IBA进行生根培养，IBA的浓度一般为0.5mg/L。

1.7 炼苗和移栽 当生根培养中的根长到3～4cm、平均根数2～3条以上时，即可进行炼苗。炼苗时首先将瓶塞打开，让其由无菌环境转至有菌且湿度较低的环境中锻炼3d，此时苗的成活率最高，可达95%以上。然后将苗取出，洗净根部附着的培养基，移栽到基质中。基质分为有机基质和无机基质，有机基质主要有壤土、泥炭土、沙土、草炭、椰糠、腐熟的猪粪等；无机基质主要有蛭石、珍珠岩、沙等。移栽时两种基质常搭配使用，最常用的是壤土+珍珠岩。

2 菊花离体快繁中的几个技术问题

2.1 外植体的处理 对外植体需要进行5个方面的处理： ①外植体的清理： 在取得外植体后，需要将其在烧杯中用饱和洗衣粉溶液漂洗或洗洁精水浸泡10～15min，再用蒸馏水冲洗20～30min，去掉表面泥土和杂质，防止其污染外植体；②外植体的修剪： 对外植体进行灭菌前，不要把茎上的嫩叶剥得太干净，以免伤口面暴露太大，导致外植体的损伤，从而影响培养效果；③外植体的灭菌： 用升汞灭菌外植体时，若处理时间过长，外植体污染率虽低，但死亡率增高，若时间过短则污染率增高，研究发现以升汞处理5min效果最好，灭菌成活率达77.8%。但升汞含有剧毒，且对环境污染严重，因此在外植体灭菌时应尽量减少升汞的使用或用其他的灭菌剂代替；④外植体的接种： 在进行外植体的接种时，需将外植体接触灭菌液的切口切去一小段，可减少灭菌药物对外植体的毒害。

2.2 培养基的参数选择 涉及2个方面的问题： ①pH值调节： pH值对培养基的凝固度有较大影响，一般培养基的pH在5.6～5.8，pH过高培养基变硬，过低培养基不能凝固；②植物生长调节剂配比： 植物生长调节剂主要分为生长素和细胞分裂素，两者的配比影响植物组织脱分化的方向。当生长素与细胞分裂素比例适中，且生长素含量高于细胞分裂素时，主要诱导形成愈伤组织和根原基；当细胞分裂素含量高于生长素时，主要诱导形成芽原基。

2.3 试管苗的成活率 由于试管苗一直处于人工控制的适宜环境，其抗病和抗干旱等能力均较弱，一旦出瓶种植，幼苗的成活率将受到影响，所以移栽初期的管理是移栽成功的关键。由于根系供水缓慢，刚移栽的幼苗要避免强光照射和增加叶表面湿度。但长时间的高湿度利于繁殖猝倒病菌，幼苗最易感染细菌、病毒，引起成活率下降，因此炼苗时间不宜过长。选择3d作为炼苗时间较合适，在移栽2d后要适当增加光照和减少湿度。

2.4 试管苗的褐化及玻璃化 在诱导愈伤过程中，由于材料基因型、生理状况和培养条件等因素影响，外植体会发生不同程度的褐化，严重影响愈伤分化诱导、再生芽形成。除此之外，在菊花组织培养过程中，还可能会产生玻璃化的丛生芽。有研究发现，AgNO3可防止培养物的褐化与玻璃化。

3 展望

菊花的离体快繁技术日趋完善，已初步建立了一套菊花组培快繁的培养程序，但该技术成本较高，所以如何通过简化培养基、简化工序以及改进移栽技术等方法来降低成本，生产出大量廉价的优良植株，是菊花离体快繁技术亟待解决的问题。